小動物超聲機在動脈粥樣硬化模型中的評價作用

陳燕芬 盧 軍 張敏州 王 磊 (廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 500)

小動物超聲機在動脈粥樣硬化模型中的評價作用

陳燕芬 盧 軍1張敏州2王 磊2(廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510120)

目的 探討一種簡單快速評價ApoE－/－小鼠動脈粥樣硬化模型成功建立與否的方法。方法 18只ApoE－/－小鼠隨機分為模型組(10只)和對照組(8只)。模型組采用高脂飼料喂養(yǎng)16 w建立動脈粥樣硬化模型，對照組予普通飼料喂養(yǎng)。造模16 w后，用Vevo2100小動物超聲機MS-550D探頭觀測ApoE－/－小鼠雙側(cè)頸動脈斑塊形成情況;并檢測甘油三酯(TG)、血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平，HE染色檢測頸動脈及主動脈病理形態(tài)學的變化。結(jié)果 與對照組相比，模型組小鼠體重較快明顯增加，頸動脈小動物超聲可見明顯的斑塊影，LDL-C及TC水平升高(P＜0.05，P＜0.01)，小鼠內(nèi)膜、中膜增厚，頸動脈斑塊形成。結(jié)論 小動物超聲可簡單快速評價動脈粥樣硬化小鼠模型建立成功與否。

小動物超聲;動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(AS)發(fā)病機制復雜，涉及血管內(nèi)皮細胞損傷、平滑肌細胞和膠原增殖、泡沫細胞形成、血小板黏附聚集、脂質(zhì)代謝障礙等方面〔1〕，可引起冠心病和腦梗死等，是嚴重危害人類健康的疾病之一。目前有多種建立動脈粥樣硬化動物模型的方法，而評價是否成功建模的方法大部分是做病理形態(tài)學檢查，但病理形態(tài)學檢查不能動態(tài)觀察斑塊，很難通過活體檢查確定是否已成功建立可靠的AS模型。小動物超聲既是無創(chuàng)技術(shù)，又可動態(tài)觀察動脈的變化。故本研究探討采用Vevo2100小動物超聲機評價ApoE－/－小鼠活體的頸動脈斑塊形成情況。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性基因敲除 ApoE－/－小鼠，8周齡，體重(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。高脂飼料〔2〕(1.25%膽固醇，15%脂肪，0.5%膽酸)購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 分組 將ApoE－/－小鼠隨機分為對照組8只(飼養(yǎng)1 w后死亡1只)，予普通飼料喂養(yǎng);模型組10只，予高脂飼料喂養(yǎng)，均16 w。

1.2.2 Vevo2100小動物超聲機檢查ApoE－/－小鼠雙側(cè)頸動脈斑塊的形成 ApoE－/－小鼠經(jīng)三溴乙醇腹腔注射麻醉后脫毛，在小鼠板上的心電圖金屬電極上涂導電膏，并將小鼠仰臥式置于小鼠板中央，用3M透明膠將小鼠的四肢緊貼于四個電極金屬片，于頸部涂上耦合劑，選用MS-550D探頭及B超模式，探頭方向為90°，對準正中的氣管位置，緩慢移動探頭到小鼠頸部，直到獲得清晰圖像，以氣管強回聲光影為標志，微調(diào)探頭方向，向左微移動，即可獲得左頸動脈的圖像，以頸動脈分叉為標志，若頸動脈內(nèi)壁見密度稍高的強回聲影即為形成的斑塊，再向右微移動，即可獲得右頸動脈的圖像，也以頸動脈分叉為標志。

1.2.3 標本收集 待飼養(yǎng)0、4、8、12、16 w之后，分別將小鼠稱重，16 w后麻醉并經(jīng)心臟取血處死，4℃冰箱1 h，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，放入－80℃冰箱備用。手術(shù)分離并取下雙側(cè)頸動脈及主動脈，用PBS沖洗，置于4%多聚甲醛溶液中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 生化指標檢測 血清樣本用生化分析儀檢測甘油三酯(TG)、血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.5 病理學檢測 將固定后的頸動脈及主動脈取出，梯度酒精脫水、石蠟包埋后切片，行HE常規(guī)染色。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件，計量資料用±s表示，組間比較采用Dunnett t檢驗，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組體重變化 兩組小鼠0 w體重無明顯差異(P=0.396);與0 w相比，模型組小鼠從第4周體重開始增加明顯(P＜0.05)，對照組小鼠從第8周體重開始增加明顯(P＜0.05);第16周時，兩組體重相比亦無明顯差異(P=0.201)(表1)。

2.2 生化指標的變化 與對照組相比，模型組LDL-C及TC水平升高(P＜0.05)，HDL-C及TG水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(表 2)。

表1 第0、4、8、12、16周兩組小鼠體重變化(g，±s)

表1 第0、4、8、12、16周兩組小鼠體重變化(g，±s)

與0 w 比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

0 w 4 w 8 w 12 w 16 w模型組 10 24.40±3.13 27.20±2.661) 29.40±2.672) 30.70±2.712) 30.90±2.332)組別 n對照組 7 25.71±2.93 28.86±3.48 30.57±2.942) 31.29±2.292) 32.29±1.702)

2.3 Vevo2100小動物超聲機評價結(jié)果 模型組可觀察到19處有斑塊的影像，斑塊面積為(0.335 6±0.020 9)mm2，斑塊面積之和達3.36 mm2;而對照組只觀察到1處有斑塊的影像，斑塊面積僅為0.06 mm2(見圖1)。

2.4 病理形態(tài)學的變化 對照組小鼠主動脈內(nèi)膜光滑平整，管壁呈半透明狀，無脂紋和斑塊形成，彈力板完整。模型組小鼠主動脈斑塊形成，泡沫細胞大量存在，淋巴細胞廣泛浸潤，內(nèi)膜、中膜增厚，血管腔明顯狹窄。見圖2。

表2 喂養(yǎng)16 w后兩組小鼠血脂水平比較(mmol/L，±s)

表2 喂養(yǎng)16 w后兩組小鼠血脂水平比較(mmol/L，±s)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 n HDL-C LDL-C TC TG模型組 10 0.69±0.45 3.41±0.522)10.39±1.841)1.14±0.44對照組7 1.39±1.04 1.34±0.44 8.54±1.23 0.80±0.40

圖1 兩組ApoE－/－小鼠AS超聲影像圖比較

圖2 ApoE－/－小鼠主動脈血管HE染色

3 討論

AS是一種慢性炎癥性血管病，全身的大、中、小動脈均可發(fā)病，發(fā)展到一定階段可繼發(fā)多種疾病。因此，AS發(fā)病機制的研究受到廣泛關注，而動物模型對研究AS和易損斑塊的發(fā)生機制和病理生理、檢測相關診斷方法的有效性和實用性、評價抗AS和防治冠心病藥物的療效是一種不可缺少的研究工具。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因敲除技術(shù)的出現(xiàn)，目前已成功培育出脂蛋白代謝基因缺陷鼠，使得鼠模型在AS模型的研究中重新受到重視。雖然使用這類基因敲除鼠容易制作成功AS斑塊的動物模型，但是評價是否成功建立可靠的AS動物模型的方法大部分是做病理形態(tài)學的檢查，但病理形態(tài)學的檢查不能實現(xiàn)動態(tài)觀察，必須處死動物取相應的組織才能進行檢查，故不能確保是否已成功建立可靠的AS模型，使得實驗周期延長甚至失敗，付出更高的實驗成本。

小動物超聲技術(shù)目前主要運用于心肌肥厚、心衰及心肌梗死等動物實驗研究，不僅可以測量頸動脈內(nèi)中膜厚度，還可以測不同部位的平均血流速度及相對壁剪切應力，如升主動脈、主動脈弓及降主動脈，甚至還能運用超聲指導小動物大動脈損傷模型的造模〔2，3〕，但是國內(nèi)鮮少有這方面的報道。

筆者運用小動物超聲技術(shù)，選擇最新型號的Vevo2100小動物超聲機，使用超高分辨率的MS-550D血管探頭，動態(tài)觀察小鼠的頸動脈情況，直至觀察到頸動脈的內(nèi)中膜增厚，甚至可明確見到密度稍高的斑塊影。病理形態(tài)學檢查結(jié)果也證明模型組造模成功。頸動脈是全身動脈的窗口，故用小動物超聲評價頸動脈血管斑塊形成的情況，可大大增加AS模型的成功率。

綜上，小動物超聲是一種簡單快速評價AS小鼠模型成功建立與否的診斷方法，并且能夠動態(tài)觀察，方便快捷，準確性高，值得在AS等動物實驗研究中推廣。

1 LUSIS AJ.Atherosclerosis〔J〕.Nature，2000;407(6801):233-41.

2 Tomita H，Hagaman J，F(xiàn)riedman MH，et al.Relationship between hemodynamics and atherosclerosis in aortic arches of apolipoprotein E-null mice on 129S6/SvEvTac and C57BL/6J genetic backgrounds〔J〕.Atherosclerosis，2012;220(1):78-85.

3 Meng X，Zhang F，Valji K，et al.Ultrasound guidance for the creation of a small animal model of aortic injury〔J〕.J Vasc Interv Radiol，2011;22(8):1193-7.

Evaluation of animal ultrasound imaging in the atherosclerosis model

CHEN Yan-Fen，LU Jun，ZHANG Min-Zhou，et al.
The Second Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120，Guangdong，China

ObjectiveTo investigate a simple and fast method for evaluating an atherosclerosis model in ApoE－/－mice，particularly with carotid atherosclerotic plaque.MethodsEighteen ApoE－/－mice were divided into two groups.The model group was fed with high fat food for 16 weeks.8 mice were fed with chow food for 16 weeks as the sham.On the 0，4th，8th，12th，16thweek after fed，the body weight was detected.The carotid artery of ApoE－/－mice was imaged with the vevo2100 animal ultrasound by MS-550D probe.On the 16th week，the levels of triglyceride(TG)，total cholesterol(TC)，low-density lipoprotein(LDL)and high-density lipoprotein(HDL)were detected.The pathological morphology of carotid artery or aorta was determined by HE staining.ResultsCompared with those of the sham，the levels of LDL and TC were increased(P＜0.05，P＜0.01)，more plaques of carotid artery were detected with the animal ultrasound imaging，carotid intima and tunica media were thickened and carotid plaque was significantly formed in model group.ConclusionsAnimal ultrasound imaging technique could be a simple and fast method to evaluate if the atherosclerosis animal model is established successfully or not.

Animal ultrasound imaging;Atherosclerosis

R743

A

1005-9202(2015)09-2310-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.003

國家自然科學基金項目(81202782);廣東省中醫(yī)院拔尖人才專項(2014KT1477)

1 廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 2 廣東省中醫(yī)院重癥醫(yī)學科

王 磊(1980-)，男，副主任醫(yī)師，博士，碩士生導師，主要從事冠心病的中西醫(yī)結(jié)合治療研究。

陳燕芬(1985-)，女，博士，主要從事重癥心血管疾病中西醫(yī)結(jié)合臨床與實驗研究。

〔2014-12-25修回〕

(編輯 徐 杰)