磷脂脂肪酸技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

黃 結(jié)，毛瑞豐

（廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530021）

食品安全是人們賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)。食品微生物是影響食品安全的重要因素之一。在食品快速流通及廣泛工業(yè)化生產(chǎn)的今天，使用簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的食品微生物檢驗(yàn)方法是保障食品衛(wèi)生安全的重要途徑。磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）技術(shù)是一項(xiàng)新興技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可重現(xiàn)等特點(diǎn)。該技術(shù)在土壤微生物[1-4]、沉積物微生物[5-6]和地下水微生物[7]等方面已有了很廣泛的應(yīng)用。但在食品微生物中的應(yīng)用報(bào)道并不多。該文對(duì)PLFA技術(shù)的基本原理和方法及其在食品微生物鑒定、分型、溯源和群落結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，為促進(jìn)該技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)方面起到更大的作用。

1 磷脂脂肪酸（PLFA）技術(shù)的基本原理和方法

1.1 基本原理

磷脂脂肪酸（PLFA）是構(gòu)成活體微生物細(xì)胞膜的重要組成部分，在真菌和細(xì)菌的細(xì)胞膜中PLFA分別約占50%和98%[8]。微生物能通過不同的生化途徑合成不同的PLFA，且細(xì)胞膜中PLFA的成分和含量是相對(duì)穩(wěn)定的，提取之后易于進(jìn)行定性和定量研究[6]。微生物中的PLFA在細(xì)胞死亡后數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)就會(huì)降解，因此檢測(cè)到的PLFA大體上反映的是活體微生物。

不同類群微生物含有PLFA的種類和數(shù)量均不相同，a15/i15/15：0、a16/i16/16：0、16：1w5/1w9/1w7t、a17/i17/17/cy17：0、18：1w5/1w7/1w7t、a19/i19/cy19：0為細(xì)菌的PLFA；18：1w9/2w6/3w6/3w3為真菌的PLFA；10Me16/10Me17/10Me18：0為放線菌的PLFA。此外，部分PLFA僅特異性地存在于某類群微生物的細(xì)胞膜中，如cy17：0和cy19：0是厭氧細(xì)菌的PLFA；16/18：1w7t是好氧細(xì)菌的PLFA。鑒于PLFA和微生物類群存在的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以通過分析樣品中的PLFA來研究樣品中微生物的生物量和群落結(jié)構(gòu)，可以通過分析PLFA構(gòu)成的變化來研究微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[6]。

1.2 方法

應(yīng)用該技術(shù)首先需要從樣品中提取PLFA。PLFA的提取和測(cè)定是PLFA技術(shù)的關(guān)鍵。PLFA的提取可以參考微生物鑒定自動(dòng)化系統(tǒng)（microbial identification system，MIS）推薦的提取方法進(jìn)行。目前，美國(guó)的MIDI公司已將PLFA技術(shù)商品化，開發(fā)了微生物鑒定自動(dòng)化系統(tǒng)。該系統(tǒng)是依據(jù)不同種類微生物PLFA類型和含量的特異性、指示性和穩(wěn)定性，對(duì)微生物進(jìn)行全自動(dòng)鑒定和分析。該系統(tǒng)從微生物的培養(yǎng)、菌的收集、微生物細(xì)胞皂化釋放脂肪酸、脂肪酸甲基化、脂肪酸甲酯的萃取和洗滌、微生物的鑒定、結(jié)果的判斷等制定成一整套完整的標(biāo)準(zhǔn)化程序。系統(tǒng)檢測(cè)出微生物的磷脂脂肪酸圖譜，然后自動(dòng)檢索其內(nèi)置的PIFA圖譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，給出匹配結(jié)果，完成微生物的鑒定。然后可經(jīng)百分歸一化處理，給出相對(duì)定量數(shù)據(jù)。若鑒定的是樣品微生物群落，可根據(jù)得到的磷脂脂肪酸圖譜多樣性，通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫和計(jì)算機(jī)分析軟件等給出樣品微生物的生物量及群落結(jié)構(gòu)多樣性。

2 PLFA技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

2.1 食品微生物的鑒定

目前，食品微生物的鑒定法大體分成4個(gè)不同水平：菌落、細(xì)胞形態(tài)和生理生化水平；細(xì)胞組分水平；蛋白質(zhì)水平；基因水平。傳統(tǒng)的形態(tài)、生化鑒定操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、靈敏度低，一旦某些表型和生化特征發(fā)生變化，其分類與命名就易出錯(cuò)[9]；采用分子生物學(xué)技術(shù)，通過DNA或RNA進(jìn)行鑒定，其操作技術(shù)要求高，且不能區(qū)分活體與死體DNA，引物序列設(shè)計(jì)具有人工選擇性。PLFA技術(shù)是從細(xì)胞組分水平上鑒定微生物，微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中普遍含有PLFA成分，且微生物的PLFA與DNA具有高度的同源性[10]。PLFA的組成和含量是相對(duì)穩(wěn)定的，一般可通過單次試驗(yàn)就能比較準(zhǔn)確地將微生物鑒定到種[11]。湯丹劍[12]對(duì)食品中常見的8株細(xì)菌（保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌）的細(xì)胞脂肪酸成分進(jìn)行檢測(cè)分析，其結(jié)果與傳統(tǒng)分類鑒定方法所得的結(jié)果相符。ODUMERU J A等[13]采用MIS系統(tǒng)對(duì)蠟樣芽胞桿菌、空腸彎曲菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌屬、產(chǎn)毒大腸埃希菌等6種食源性病原菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，MIS鑒定的重復(fù)性蠟樣芽胞桿菌最好，其次為空腸彎曲菌、沙門菌屬。杜春明等[14]對(duì)不同食物來源的唐菖蒲伯克霍爾德菌中不同致病型菌株的脂肪酸成分進(jìn)行測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)它們的脂肪酸成分基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了唐菖蒲伯克霍爾德菌、椰毒假單胞菌和椰毒假單胞菌酵米面亞種是屬于同一個(gè)種。郭愛玲等[15]通過氣相色譜對(duì)食品中常見并已知的15株革蘭氏陰性致病菌的細(xì)胞脂肪酸組分進(jìn)行分析，可以清晰的分出不同屬和不同種之間有明顯的差異。HOFFMANN M等[16]使用脂肪酸甲酯鑒定分析從食品和環(huán)境中分離的30株阪崎腸桿菌，得出脂肪酸的測(cè)定有高度重復(fù)性，可用于快速檢查嬰幼兒配方樣品中的阪崎腸桿菌。呂均等[17]對(duì)武漢市疾病預(yù)防控制中心從食品及食品中毒中檢驗(yàn)分離出的14株病原菌及其所屬種的模式菌株，用氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）對(duì)其進(jìn)行全細(xì)胞脂肪酸組分的分析，結(jié)果表明，各個(gè)屬之間可通過特征脂肪酸圖譜鑒定出來，并可通過雙鍵脂肪酸上的位置差異鑒定出模式菌株與地方菌株。

2.2 食品微生物的分型

PLFA圖譜對(duì)菌株差異非常靈敏，已成功應(yīng)用于食品微生物的分型研究。鄭華英等[18]對(duì)食品中分離出來的6種沙門氏菌（伊斯特爾本沙門菌、豬霍亂沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌、阿貢納沙門菌、徹斯特沙門菌、鴨沙門氏菌）在相同的條件下培養(yǎng)，通過氣相色譜測(cè)定脂肪酸的組成，結(jié)果表明，沙門菌屬中的細(xì)菌在脂肪酸的組成上主要含C12、C16、C18、C19，伊斯特爾本沙門菌、豬霍亂沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌、阿貢納沙門菌、徹斯特沙門菌、鴨沙門氏菌的氣相色譜圖極其相似，但又并不是完全相同，在組分及含量上表現(xiàn)出一定的差異。秦巧玲等[19]用氣相色譜-質(zhì)譜分析4種已知的志賀氏菌（其中的地方菌株是從食品中分離得到），志賀氏菌脂肪酸成分都具有一定的特征，4個(gè)種之間也表現(xiàn)出一定的差異，同種不同來源的地方菌株表現(xiàn)出一定差異。GUO A等[20]通過微生物鑒定系統(tǒng)MIS對(duì)不同食物來源中分離的22株單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行全細(xì)胞脂肪酸鑒定分析，結(jié)果表明，基于這22株菌的脂肪酸可分成三大組，發(fā)現(xiàn)這跟食物來源也密切相關(guān)，同一食物源在同一組，不同食物源在不同組。狄慧玲等[21]對(duì)從河北地區(qū)六類食品中分離得到的90株單核細(xì)胞增生李斯特菌（LM）提取脂肪酸，利用MIDI公司Sherlock系統(tǒng)進(jìn)行菌體脂肪酸成分分析，使用SPSS19.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及聚類分型，并將脂肪酸分型與傳統(tǒng)的血清分型和分型金標(biāo)準(zhǔn)脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型進(jìn)行比較，結(jié)果表明，脂肪酸分型法判定LM菌的符合率為96.67%。

2.3 食品微生物的溯源

同種不同來源菌株的PLFA組分存在細(xì)微差異，對(duì)這些差異數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，可判斷出菌株間的親緣關(guān)系。趙暉等[22]對(duì)美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心和中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心各一株標(biāo)準(zhǔn)菌株及從食品中分離的5株單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行脂肪酸組分分析，結(jié)果表明，同種的大部分主要脂肪酸組分是相同的，但不同來源的菌株間一些微小的脂肪酸組分有差異。因而可以通過脂肪酸組分的微小差異對(duì)微生物追蹤溯源。

在食品加工中應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行菌株溯源分析，對(duì)推測(cè)污染源、明確污染途徑、預(yù)防和消除產(chǎn)品受微生物破壞等方面具有重要意義。MALFEITO-FERREIRA M等[23]在葡萄酒裝瓶廠和葡萄酒中的菌株進(jìn)行脂肪酸圖譜檢測(cè)，追蹤破壞最終產(chǎn)品的菌株來源，結(jié)果表明，在精過濾器的出口確定為接合酵母的來源，灌裝機(jī)的入口發(fā)現(xiàn)畢赤酵母的來源。這給廠家消除產(chǎn)品的有害菌株提供了指導(dǎo)方向。HINTON A等[24]使用MIDI脂肪酸甲酯分析對(duì)某商家的家禽加工中的雞肉和燙傷水從一月～六月進(jìn)行彎曲桿菌的監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，從三月～六月的雞肉和燙傷水中檢出病原體，且彎曲桿菌的數(shù)量在家禽尸體冷藏儲(chǔ)存期間普遍下降，這可以幫助商家明確污染源，為預(yù)防和減少病原體采取必要的措施。該技術(shù)也可以應(yīng)用在細(xì)菌性食物中毒查找污染源中，但是這方面的報(bào)道甚少。該技術(shù)可以作為一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的手段快速找出相似菌株，再結(jié)合使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）法對(duì)相似度高的菌株進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，從而為有效提高污染源的控制縮短時(shí)間。

2.4 食品微生物群落結(jié)構(gòu)的分析

微生物群落結(jié)構(gòu)可通過各微生物類群的特征脂肪酸的相對(duì)含量表征[25]。目前，PLFA只能粗略地區(qū)分革蘭氏陽性菌G+、革蘭氏陰性菌G-、好氧細(xì)菌、厭氧細(xì)菌、真菌等。微生物多樣性一直是微生物生態(tài)學(xué)研究的重要內(nèi)容。分析食品不同時(shí)期的微生物群落結(jié)構(gòu)含量變化是反映食品質(zhì)量變化的重要指標(biāo)，這在食品加工、貯存等方面具有重要的指導(dǎo)意義。趙金松等[26]采用PLFA技術(shù)對(duì)4種不同的醬香型大曲進(jìn)行研究，結(jié)果表明，醬香大曲主要由真菌、G+細(xì)菌、G-細(xì)菌等組成，優(yōu)勢(shì)菌群均為真菌，總PLFA含量表現(xiàn)為瀘州老窯大曲＞國(guó)臺(tái)大曲＞郎酒大曲＞仙潭大曲。

3 PLFA技術(shù)存在的不足

雖然PLFA技術(shù)應(yīng)用于微生物研究已有了很長(zhǎng)時(shí)間，但也有不足。

（1）不同種屬之間的PLFA常常會(huì)有所重疊，這個(gè)覆蓋效應(yīng)在鑒定微生物群落結(jié)構(gòu)上會(huì)導(dǎo)致生物量的過量估算[27]。

（2）PLFA的組成會(huì)受細(xì)胞所處的外部環(huán)境條件的影響，也會(huì)受細(xì)胞內(nèi)部情況的影響[28-29]。有研究指出，一些菌株的細(xì)胞脂肪酸組成和含量會(huì)隨著環(huán)境的溫度、pH值、培養(yǎng)時(shí)間、搖瓶轉(zhuǎn)速、碳源種類和濃度等變化而變化[30-32]。

（3）古菌的極性脂質(zhì)是以醚鍵（二醚與四醚成分）為主[33]，而不是以酯鍵的形式出現(xiàn)，因此不能使用PLFA技術(shù)分析古菌的組成。

（4）對(duì)某些菌落指征有時(shí)不夠準(zhǔn)確，且食品中所有生物的特征PLFA未完全確立。因此還要不斷完善PLFA技術(shù)，完善不同菌種的特定PLFA數(shù)據(jù)庫。

4 展望

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，PLFA技術(shù)越來越多地引起人們的重視。PLFA技術(shù)突破了傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)手段的限制，已越來越多地應(yīng)用于食品微生物的鑒定、分型、溯源和群落結(jié)構(gòu)的研究中。由于PLFA技術(shù)只檢測(cè)活的那部分微生物，并且能有效地提供微生物群落信息，所以，該技術(shù)可以用來研究發(fā)酵食品加工中特異性微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，為控制和保證產(chǎn)品的質(zhì)量提供技術(shù)支撐。由于該技術(shù)存在一些不足，可研究改進(jìn)試驗(yàn)方案，不斷完善PLFA技術(shù)，并且在進(jìn)行食品微生物溯源、群落組成及變化等研究中，需要與其他技術(shù)方法結(jié)合起來使用，如核酸技術(shù)、變性凝膠梯度電泳技術(shù)（denatruing gradient gel electrophoresis，DGGE）等，以達(dá)到更好的使用效果。

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