新型豬繁殖與呼吸障礙綜合征疫苗研究進展

呼高偉，蔡 杰，余婉婷，馮朝興，王乃東，鄧治邦，王愛兵，楊 毅

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410128 ；2.天津市濱海新區(qū)漢沽茶淀畜牧獸醫(yī)站，天津 漢沽300480）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）是由病毒性抗原PRRSV（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）引起的，臨床上以豬的呼吸和繁殖障礙為主要特征，如豬妊娠后期流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬死亡率升高，肥育豬生長緩慢以及各年齡段豬的呼吸道疾病。目前，本病在全球范圍內(nèi)流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。我國將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征列為二類動物傳染病。

1 PR R S V 分子結(jié)構(gòu)特征

PRRSV 為不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒，分子量大小約為15 kb，直徑為50～65 nm，有囊膜，包含9 個開放閱讀框（Opening Reading Frame，ORFs）（ORF1a，ORF1b 和ORF2-7）分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。關(guān)于PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的最新發(fā)現(xiàn)為研究者對PRRSV 生物學(xué)特性和疫苗的研制提供了全新的視野。PRRSV 具有高度的變異性，傳統(tǒng)疫苗效果不理想，導(dǎo)致本病愈演愈烈，危害也越來越嚴重。本文就目前有關(guān)抗PRRSV的不同類型新型疫苗的優(yōu)缺點和設(shè)計策略進行探討，以期為臨床實踐進行抗PRRSV 疫苗有效選擇、對PRRSV 的控制和預(yù)防措施，提供理論指導(dǎo)。

2 新型疫苗的開發(fā)

2.1 基因工程疫苗 基因工程疫苗具有安全、可修飾性強、制作工藝簡單、可同時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應(yīng)等優(yōu)點。目前，針對PRRSV 的基因工程疫苗的研究的候選基因，主要是圍繞PRRSV 結(jié)構(gòu)蛋白GP5 進行的，因為GP5 蛋白包含多個中和抗原表位。另外，GP5 是病毒的一個主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒粒子中存在的量多可以作為很好的免疫原。

2.1.1 DNA 疫苗 DNA 疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是編碼免疫原或與免疫原相關(guān)的真核表達質(zhì)粒DNA（有時也可是RNA），它可經(jīng)一定途徑進入動物體內(nèi)，被宿主細胞攝取后轉(zhuǎn)錄和翻譯表達出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到免疫保護作用。有研究證明，位于GP5 基因中和表位（表位B）上游的“誘餌”表位（表位A）明顯影響抗PRRSV 中和抗體的產(chǎn)生。Fang 等[2]通過人工修飾的方法，在GP5 基因中的“誘餌”表位（表位A）和中和抗體表位（表位B）之間插入通用型輔助性T 淋巴細胞表位（Pan DR T-helper cell epitope），以此削弱非中和表位的作用。將經(jīng)修飾后的GP5 基因制成DNA疫苗，免疫小鼠結(jié)果顯示，接種修飾GP5 基因后的DNA 疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的中和抗體水平要明顯高于野生型GP5 制成的DNA 疫苗，說明經(jīng)修飾后的GP5 的免疫原性明顯增強。有研究證實，將GP5 基因N-端胞外區(qū)中部分糖基化位點（Nlinked glycosylation site，NGS）進行突變能增強體外病毒對中和抗體的敏感性和中和表位的免疫活性[3]。

2.1.2 活病毒載體疫苗 腺病毒載體表達系統(tǒng)可高效地傳遞和表達外源基因的能力，已得到充分證實。而且腺病毒具備病毒顆粒比較穩(wěn)定、基因組較少發(fā)生重排等優(yōu)點，已經(jīng)成為最常用的病毒載體之一。研究者Jiang 等[4]結(jié)合上述結(jié)論，分別構(gòu)建了表達野生型GP5 和1～4 NGS 突變型：N44S、N44/51S、N30/44/51S、N30/33/44/51S 和N30/33S 的重組腺病毒。這6 種重組病毒分別接種小鼠，結(jié)果顯示，5 種表達突變型GP5 的腺病毒所誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)明顯強于表達野生型GP5 的腺病毒，但是它們所引起的淋巴細胞增殖反應(yīng)卻沒有明顯差異。GP5 蛋白糖基化殘基的缺失能明顯增強GP5 蛋白的免疫原性，作者推斷這可能是因為糖基化殘基的去除暴露了GP5 蛋白的某些中和表位。研究者Anbu K[5]利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達產(chǎn)生PRRSV 的包膜糖蛋白GP2a、GP3、GP4、GP5 蛋白，表達產(chǎn)生的抗原蛋白分子跟感染性的PRRSV 病毒顆粒極為相似。這些抗原蛋白分子能夠展示在桿狀病毒的表面，并且這種新型的桿狀病毒能將抗原分子轉(zhuǎn)導(dǎo)進入豬器官細胞內(nèi)。這種新型抗原分子，接種小鼠后，結(jié)果顯示，抗原分子能高效地誘導(dǎo)抗PRSSV 中和抗體的產(chǎn)生。

2.1.3 嵌合疫苗 主要是利用RNA 病毒反向遺傳操作系統(tǒng),構(gòu)建并拯救嵌合病毒和突變病毒來設(shè)計新型疫苗。Wang等[6]將疫苗株MLV 和強毒株MN184的非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)互換，拯救的rMN184 和rMLV 均為致弱病毒，且rMN184 免疫接種的豬群能快速產(chǎn)生高水平抗體。

2.1.4 DIVA 疫苗 DIVA 疫苗又叫標記疫苗，能將接種疫苗的動物能與野毒感染的動物區(qū)分，這有利于病原流行的監(jiān)測，也有利于豬場的疫病的控制和根除。Lima 等[7]首先鑒定了美洲型PRRSV NVSL 97-7895 的Nsp2 和結(jié)構(gòu)蛋白中的B 細胞抗原表位，隨后在感染性克隆中分別對Nsp2 上兩個抗原表位編碼序列進行缺失，并拯救出突變病毒。其中一個突變病毒FLdNsp2/44 接種豬只的實驗結(jié)果顯示，突變病毒也能刺激機體產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)，且檢測不到缺失表位對應(yīng)的抗體。而在親本病毒接種的豬血清中，可檢測到明顯的缺失表位對應(yīng)的抗體。因此作者認為，該方法可用于PRRSV DIVA 疫苗的研發(fā)。

2.1.5 病毒樣顆粒亞單位疫苗 病毒樣顆粒(Virus-Like Particles，VLPs)是含有某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒有病毒的核酸（DNA/RNA），不能自主復(fù)制，其在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細胞，有效地誘導(dǎo)機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)。病毒樣粒子不含有遺傳物質(zhì)，安全性好，所以成為一種理想的預(yù)防病毒病的候選疫苗。研究者Nam等[8]利用桿狀病毒表達系統(tǒng)將PRRSV 的GP5 和M蛋白進行共表達，構(gòu)建成一種VLPs。免疫接種小鼠后發(fā)現(xiàn)針對GP5 的IgG 滴度水平明顯高于對照組。接種VLPs 3 d 后進行檢測細胞因子水平，發(fā)現(xiàn)免疫接種4.0 μg VLPs 后的小鼠產(chǎn)生的r 干擾素水平（Interferon-gamma，IFN-r），IL-4、IL-10 細胞因子水平較對照組明顯增高。VLPs 候選疫苗的開發(fā)與研制為抗PRRSV 的疫苗研究提供了新的嘗試和思路。

2.1.6 表位疫苗 表位疫苗（Epitope Vaccine）是以抗原表位為基礎(chǔ)制備的疫苗，是近期發(fā)展起來的一種獨特的新型疫苗設(shè)計思路。研究者Chen 等[9]發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白GP96 能夠增強PRRSV 亞單位疫苗的免疫原性。隨后，研究者Chen[10]以GP96作為免疫佐劑，人工合成PRRSV B、T 細胞表位肽段構(gòu)建成表位疫苗，研究其免疫原性。結(jié)果顯示，抗PRRSV 的體液免疫和細胞免疫反應(yīng)明顯增強。而且，細胞因子IL-12 和腫瘤壞死因子α分泌水平提高。高致病性藍耳病JXwn06 株攻毒接種后，豬只的臨床癥狀、病毒血癥、病理性器官損傷程度得到明顯改善。但是，這種表位疫苗卻無法針對高致病性藍耳病毒感染提供有效地持續(xù)性保護。

2.1.7 轉(zhuǎn)基因植物疫苗 轉(zhuǎn)基因植物疫苗（transgenie plant vaccine）或植物疫苗（plant-based vaccine）是借助植物遺傳轉(zhuǎn)化載體將抗原基因?qū)胫参?，利用植物本身生命活動，使其在植物中表達，生產(chǎn)出能使機體獲得特異抗病能力的疫苗。Hu 等[11]將玉米愈傷組織經(jīng)過遺傳學(xué)改造，表達PRRSV 的M 蛋白，將轉(zhuǎn)基因植物提取物口服接種小鼠后結(jié)果顯示，在血清和腸道黏膜都有針對抗原的特異性中和抗體的產(chǎn)生。最后一次免疫刺激接種后，血清中中和抗體滴度達到6.7。在小鼠脾細胞中檢測出針對PRRSV 的IFN-γ的分泌。研制成功的食用疫苗，接種機體后能刺激機體黏膜免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，因此在一定程度上可以抵御經(jīng)消化道傳播的疾病，而且可以簡化免疫方法，節(jié)約成本，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 問題與展望

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外針對PRRS 的疫苗研究非?；钴S，但PRRSV 仍然是當今危害養(yǎng)豬業(yè)的一大難題，這是值得每位研究者思考的問題。另外，針對各種不同的疫苗的免疫效果沒有一個統(tǒng)一的評價標準，研制成功的疫苗免疫原性參差不齊。PRRSV 由于其生物學(xué)特性、免疫逃避、抗原性、基因型存在廣泛的變異性等特征，導(dǎo)致其在豬群中持續(xù)性感染。這些問題，大大增加了PRRSV 疫苗研究的難度，但同時也使得更加高效、安全的疫苗研制與開發(fā)顯得得更加迫切。開發(fā)新的抗PRRSV 疫苗的新的策略和需要努力的方向是：（1）設(shè)計的疫苗以豬樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）作為靶標，來增強疫苗的免疫原性[12]；（2）解決抑制協(xié)調(diào)性T 細胞的作用[13]；（3）強烈誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素[14]，增強機體非特異性免疫力。另外PRRSV 存在抗體依賴性增強現(xiàn)象，所以不僅要能誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生強烈的體液免疫反應(yīng)，更重要的是能夠有效刺激豬體產(chǎn)生較強的細胞免疫，達到對豬體形成完全保護的目的。這將需要對PRRSV 的分子結(jié)構(gòu)和功能，免疫逃避機制進行深入研究，徹底弄清其致病機理。

[1] Dea S，Gagnon C A，Mardassi H，et al.Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome（PRRS）virus：comparison of the North American and European isolates[J].Arch.Virol，2000，145（4）：659-688.

[2] Fang L，Jiang Y，Xiao S，et al.Enhanced immunogenicity of the modified GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virus Genes，2006，32（1）：5-11.

[3] 鄭其升，李鵬，畢志香，等.PRRSV NJ-a 株ORF5 基因A 表位的修飾與糖基化位點的突變對其DNA 疫苗免疫效力的影響[J].生物工程學(xué)報，2007，23（1）：33-39.

[4] Jiang W，Jiang P，Wang X，et al.Influence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 glycoprotein N-linked glycans on immune responses in mice[J].Virus Genes，2007，35（3）：663-671.

[5] Anbu K，Karuppannan，Jia Q，et al.A novel baculovirus vector shows efficient gene delivery of modified porcine reproductive and respiratory syndrome virus antigens and elicits speci fi c immune response [J].Vaccine，2013，31（46）：5471-5478.

6] Wang Y，Liang Y，Han J，et al.Attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain MN184 using chimeric construction with vaccine sequence[J].Virology，2008，371（2）：418-422.

[7] De M L，Byungjoon K W，Israrul H A，et al.Development of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus differentiable（DIVA）strain through deletion of specific immunodominant epitopes[J].Vaccine，2008，26（29-30）：3594-3600.

[8] Nam H M，Chae K S，Song Y J，et al.Immune responses in mice vaccinated with virus-like particles composed of the GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Arch Virol，2013，158（6）：1275-1285.

[9] Chen C W，Li J，Bi Y H，et al.Gp96 enhances the immunogenicity of subunit vaccine of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virus Res，2012，167（2）：162-172.

[10] Chen C W，Li J，Bi Y H，et al.Synthetic B- and T-cell epitope peptides of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus with Gp96 as adjuvant induced humoral and cell-mediated immunity[J].Vaccine，2013，31（14）：1838-1847.

[11] Hu J Z，Ni Y Y，Barbara A，et al.Immunogenicity study of plantmade oral subunit vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）[J].Vaccine，2012，30（12）：2068-2074.

[12] McCullough K C，Summerfield A.Targeting the porcine immune system-particulate vaccines in the 21st century[J].Dev.Comp. Immunol，2009，33（3）：394-409.

[13] Huang Y W，Meng X J.Novel strategies and approaches to develop the next generation of vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）[J] . Virus Research，2010，154（1-2）：141-149.

[14] Beura L K，Sarkar S N，Kwon B.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus nonstructural protein 1beta modulates host innate immune response by antagonizing IRF3 activation[J].J.Virol，2010，84（3）：1574-1584.