microRNAs作為結(jié)核分枝桿菌感染標(biāo)志物的研究進(jìn)展

張文慧，楊丹鳳，董浩，韓鵬，賈宇，張林波

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118)

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microRNAs作為結(jié)核分枝桿菌感染標(biāo)志物的研究進(jìn)展

張文慧，楊丹鳳，董浩，韓鵬，賈宇，張林波*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118)

微小RNA(microRNAs)是一類長度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控，在免疫系統(tǒng)的調(diào)控和運(yùn)行中具有重要作用。結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，其感染能夠引起人畜共患結(jié)核病。從microRNAs與結(jié)核免疫機(jī)制的相關(guān)性以及在結(jié)核分枝桿菌感染過程中巨噬細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞及血清中microRNAs表達(dá)譜變化等方面，進(jìn)行綜述microRNAs作為結(jié)核分枝桿菌感染標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀，以期為動(dòng)物結(jié)核病檢測提供理論參考。

微小RNA；結(jié)核分枝桿菌；標(biāo)志物

結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)菌，其感染可引起人獸共患的慢性傳染病-結(jié)核病，嚴(yán)重威脅人類和動(dòng)物的健康[1]。人類結(jié)核病預(yù)防用藥以注射卡介苗(BCG) 為主，BCG是牛型結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株經(jīng)13年傳代培養(yǎng)獲得的減毒株，但臨床應(yīng)用驗(yàn)證其免疫效果大約在接種10～15年后逐漸減弱，而且無法預(yù)防潛伏性結(jié)核感染[2]。目前我國牛結(jié)核病診斷主要應(yīng)用PPD方法，但由于結(jié)核免疫機(jī)制的復(fù)雜性和多變性，以及結(jié)核分枝桿菌的人獸交叉感染性，極大的阻礙了結(jié)核病診斷的研究[3]。因此尋找穩(wěn)定、有效的結(jié)核分枝桿菌感染標(biāo)志物就顯得尤為重要。microRNAs是由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸左右的小RNA分子，它參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控，在免疫系統(tǒng)的調(diào)控和運(yùn)行中具有重要作用[4]。已有研究表明microRNAs與結(jié)核分枝桿菌感染的免疫機(jī)制密切相關(guān)，有望成為結(jié)核病早期診斷標(biāo)志物。本文從microRNAs與結(jié)核免疫機(jī)制的相關(guān)性以及在結(jié)核分枝桿菌感染過程中巨噬細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞及血清中microRNAs表達(dá)譜變化等方面進(jìn)行綜述，以期為動(dòng)物結(jié)核病檢測提供理論參考。

1 microRNAs與結(jié)核免疫機(jī)制的相關(guān)性

在感染過程中，結(jié)核桿菌首先要克服先天免疫系統(tǒng)的屏障，才能成功感染宿主生物體[5]，吞噬細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞為先天免疫防御入侵的病原體提供第一道防線。巨噬細(xì)胞和結(jié)核桿菌對抗產(chǎn)生細(xì)胞因子，細(xì)胞因子繼而使肺部巨噬細(xì)胞超活化，結(jié)核病的炎癥反應(yīng)恰是由巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核桿菌并召集其他免疫細(xì)胞參與戰(zhàn)斗而導(dǎo)致的[6]。microRNAs是哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)器，參與調(diào)節(jié)結(jié)核免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)及控制巨噬細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，在結(jié)核宿主病原反應(yīng)中起重要作用[7-8]。Spinelli等[9]2013年發(fā)現(xiàn)結(jié)核病經(jīng)過專業(yè)治療后microRNAs與結(jié)核宿主反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)水平呈現(xiàn)相關(guān)性。Ma等[10]2014年發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中miR-124可以作為一種有效的免疫調(diào)節(jié)器，當(dāng)用卡介苗感染RAW264.7巨噬細(xì)胞和鼠巨噬細(xì)胞后，miR-124能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中Toll樣受體的信號(hào)活性，通過靶向調(diào)節(jié)Toll樣受體信號(hào)家族的多種組分來調(diào)節(jié)結(jié)核桿菌觸發(fā)的炎癥反應(yīng)。Liu等[11]2013年發(fā)現(xiàn)miR-582-5p通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FOXO1的表達(dá)來抑制單核細(xì)胞的凋亡，并在抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Singh等[12]2013年發(fā)現(xiàn)了結(jié)核桿菌的新型宿主免疫逃避機(jī)制，在結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv感染樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞后，miR-99b的表達(dá)量高度上調(diào)；用RNA拮抗劑抑制miR-99b的表達(dá)導(dǎo)致樹突細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌顯著減少；敲除樹突細(xì)胞中miR-99b后促炎性細(xì)胞因子如IL-6、IL-12和IL-1β顯著上調(diào)；抑制miR-99b能增強(qiáng)TNF-α和TNFRSF-4的產(chǎn)生。以上研究表明，microRNAs與結(jié)核免疫調(diào)節(jié)機(jī)制具有高度相關(guān)性，一些microRNAs可能通過調(diào)控免疫相關(guān)基因而參與結(jié)核的發(fā)病機(jī)制。

2 microRNAs與結(jié)核病診斷的相關(guān)性

疾病早期診斷是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的主要挑戰(zhàn)之一，其最大優(yōu)勢為，能通過對疾病進(jìn)行早期干預(yù)減少病原侵入而提高疾病的治愈率。選擇專業(yè)性強(qiáng)的標(biāo)志物作為診斷依據(jù)在早期疾病診斷中至關(guān)重要。結(jié)核病的早期診斷對于結(jié)核的有效控制和治療都非常重要，因此可以利用某些生物標(biāo)志物提高結(jié)核診斷質(zhì)量[13]。已有研究表明，microRNAs由于免受內(nèi)源性核糖核酸酶作用而在組織、血清和血漿中穩(wěn)定存在，這些循環(huán)的microRNAs有潛力成為疾病診斷標(biāo)志物及疾病治療的靶標(biāo)[14]。

2.1 巨噬細(xì)胞內(nèi)microRNAs表達(dá)譜變化 人類感染結(jié)核桿菌后會(huì)引起巨噬細(xì)胞內(nèi)microRNAs表達(dá)譜的變化，與潛伏性結(jié)核病發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，能提高對潛伏性結(jié)核病的診斷和預(yù)測[15]。Liu等[16]2014年采用微陣列法分析卡介苗感染后巨噬細(xì)胞內(nèi)microRNAs的表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)有10種表達(dá)量下調(diào)和8種表達(dá)量上調(diào)。2013年Furci等[17]采用TaqMan低密度序列分析法，確定毒力結(jié)核分枝桿菌H37Rv和化學(xué)滅活后無毒力的牛分枝桿菌卡介苗菌株(BCG)，感染人類原代單核巨噬細(xì)胞后microRNAs表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)感染殺傷性毒力菌時(shí)miR-155和miR-146a會(huì)出現(xiàn)標(biāo)志性變化。2013年Das等[18]用微陣列分析法分析有毒的H37Rv和無毒的H37Ra結(jié)核分枝桿菌感染THP-1巨噬細(xì)胞后microRNAs表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)H37Rv和H37Ra感染后巨噬細(xì)胞中9種microRNAs (miR-30a, miR-30e, miR-155, miR-1275, miR-3665, miR-3178, miR-4484, miR-4668-5p和miR-4497)的表達(dá)譜發(fā)生改變。

2.2 外周血單核細(xì)胞microRNAs表達(dá)譜變化 結(jié)核病人microRNAs的表達(dá)量，大多數(shù)和炎癥反應(yīng)相關(guān)，為了研究microRNAs在結(jié)核病中的作用，2011年Liu等[19]采用微陣列法分析了肺結(jié)核患者和健康人外周血單核細(xì)胞中microRNAs表達(dá)譜變化，并通過熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者與健康對照組相比有30種microRNAs的表達(dá)量改變，其中28種表達(dá)量上調(diào)和2種表達(dá)量下調(diào)；在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中miR-144*過表達(dá)，通過miR-144*轉(zhuǎn)染T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ的產(chǎn)生和T細(xì)胞的增殖來調(diào)節(jié)抗結(jié)核的免疫應(yīng)答反應(yīng)。Wu等[20]2012年采用微陣列法檢測了結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)誘導(dǎo)后，人外周血單核細(xì)胞中microRNAs表達(dá)譜變化。然后通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)對顯著活性的microRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)PPD誘導(dǎo)后microRNA-155在健康對照組變化1.4倍，而在活動(dòng)性結(jié)核病組變化3.7倍；microRNA-155*在健康對照組變化1.9倍，而在活動(dòng)性結(jié)核病組變化4.6倍。2011年Wang等[21]采用微陣列法分析結(jié)核病人和健康對照組外周血單核細(xì)胞中microRNAs表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，結(jié)核病人外周血單核細(xì)胞中miR-365和miR-424的表達(dá)量顯著變化；潛伏性結(jié)核病患者的 miR-130a*、 miR-493*、 miR-520d-3p和miR-661表達(dá)量升高，miR-296-5p表達(dá)量下降；活動(dòng)性結(jié)核患者的miR-21*、miR-223、miR-302a、miR-424、miR-451和miR-486-5p表達(dá)量升高，miR-130b*表達(dá)量下降。

2.3 血清中microRNAs表達(dá)譜變化 自從Lawrie等[22]首次提出microRNAs在血清中能被可靠的檢測出來，其在疾病診斷中的作用越來越得到研究者的重視，因此血清microRNAs有望成為結(jié)核病診斷的潛在標(biāo)志物[23-24]。2011年Yi等[25]用微陣列分析法檢測活動(dòng)性結(jié)核病人及健康人血清中microRNAs的表達(dá)量，并用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，在檢測的1223種microRNAs中有92種的表達(dá)量發(fā)生改變，其中有59種表達(dá)量下調(diào)，33種表達(dá)量上調(diào)； 其中表達(dá)量上調(diào)的miR-29a能夠敏感特異的區(qū)分結(jié)核病人與健康對照組。Qi等[26]2012年采用TaqMan低密度序列分析法(TLDA)對30例活動(dòng)性結(jié)核病人、60例百日咳桿菌(BP)，水痘 - 帶狀皰疹病毒(VZV)和腸道病毒(EV)病人血清中microRNAs的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病人與健康對照組相比有97種microRNAs的表達(dá)量發(fā)生改變，其中有90種表達(dá)量上調(diào)，7種表達(dá)量下調(diào)；用qRT-PCR方法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-361-5p，miR-889和miR-576-3p三種microRNAs因具有穩(wěn)定的敏感性和特異性能夠用來區(qū)分肺結(jié)核病人、健康人、和其他微生物傳染病。Zhang等[27]2013年采用Solexa序列分析法發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病人與健康對照組相比血清中有91種microRNAs的表達(dá)量發(fā)生變化，用qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在肺結(jié)核病人、健康對照組及不同診斷組(肺炎、肺癌和慢性阻塞型肺炎)血清中六種 microRNAs(hsa-miR-378、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-22、hsa-miR-29c、hsa-miR-1和hsa-miR-320b)顯著改變。Zhang等[28]2014年利用solexa測序法分析活動(dòng)性結(jié)核病人、卡介苗免疫過的健康人和未注射過卡介苗的潛伏性結(jié)核感染者血清中microRNAs的表達(dá)譜變化，通過microRNA—基因網(wǎng)對表達(dá)譜變化的microRNAs進(jìn)行目標(biāo)預(yù)測，并分析感染路徑發(fā)現(xiàn)，microRNAs調(diào)節(jié)的宿主免疫反應(yīng)可能是結(jié)核發(fā)病機(jī)理的一個(gè)主要因素，通過qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)hsa-miR-196b和hsa-miR-376c可能是活動(dòng)性結(jié)核病潛在的生物標(biāo)記物。

3 小結(jié)

結(jié)核分枝桿菌的感染可引起人-獸共患結(jié)核病，結(jié)核病的快速診斷及治療是世界性的公共衛(wèi)生問題。microRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類進(jìn)化上相對比較保守，由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸左右的小RNA分子。上述大量研究表明，microRNAs與結(jié)核病感染的免疫機(jī)制密切相關(guān)，某些microRNAs能夠通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化信號(hào)通路中的組分，進(jìn)而調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌感染所觸發(fā)的炎癥反應(yīng)，在結(jié)核病的診斷中表現(xiàn)出很大的應(yīng)用潛力。同時(shí)，巨噬細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、血清中microRNAs表達(dá)譜變化的研究表明，microRNAs調(diào)節(jié)的宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)可能是結(jié)核發(fā)病的一個(gè)主要因素。這些研究為microRNAs作為結(jié)核分枝桿菌感染標(biāo)志物的研究奠定了良好的基礎(chǔ)，通過研究期望能夠找到一種或幾種特定的microRNAs分子，通過其表達(dá)量的上調(diào)或下調(diào)預(yù)測結(jié)核分枝桿菌的感染狀況，進(jìn)而為以早期診斷為核心理念的動(dòng)物疾病分子診斷技術(shù)提供新思路，為動(dòng)物結(jié)核病的早期檢測提供參考。

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(編輯：陳希)

Progress in MicroRNAs as Infective Biomarkers of Infection ofMycobacteriumtuberculosis

ZHANG Wen-hui, YANG Dan-feng, DONG Hao, HAN Peng, JIA Yu, ZHANG Lin-bo*

(JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

MicroRNA is a kind of non-coding single stranded RNA molecules formed by about 22 nucleotides. It involved in regulation after gene transcription and plays an important role in the regulation and operation of the immune system.Mycobacteriumtuberculosisis the typical parasitic bacterium in the cell, and its infection can cause zoonosis. It is reviewed in this article that the progress in microRNAs as infective biomarkers of infection ofMycobacteriumtuberculosisfrom the correlation of microRNAs with tuberculosis immune mechanism and microRNAs expression changes in macrophages, mononuclear cells and serum in the process of infection ofMycobacteriumtuberculosis, which may provide the theoretical reference for the detection of animal tuberculosis.

microRNA;Mycobacteriumtuberculosis; biomarker; progress

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(20130101105JC，20140204018YY)

張文慧，副教授，從事病原微生物與免疫學(xué)研究；楊丹鳳，碩士，從事病原微生物研究,與張文慧為并列第一作者。

張林波。E-mail:cczlb@126.com

2015-07-21

A

1002-1280 (2015) 10-0062-04

Q939.93