內(nèi)質網(wǎng)應激與腫瘤細胞耐藥的相關機制

顏媛媛，何 苗，魏敏杰

(中國醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，遼寧 沈陽 110000)

內(nèi)質網(wǎng)應激與腫瘤細胞耐藥的相關機制

顏媛媛，何 苗，魏敏杰

(中國醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，遼寧 沈陽 110000)

內(nèi)質網(wǎng)是真核細胞內(nèi)一種重要的細胞器，當細胞低氧、糖類供應不足或有化學藥物處理時均可引發(fā)內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)。目前研究表明，內(nèi)質網(wǎng)應激可激活多條通路，其中以未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)通路研究最為廣泛。UPR通路激活后，可參與調控腫瘤細胞耐藥。其中，參與的機制涉及DNA損傷修復、凋亡抑制、自噬等。

內(nèi)質網(wǎng)應激; 腫瘤耐藥; UPR; ERS; 凋亡抑制; 自噬

內(nèi)質網(wǎng)是真核細胞內(nèi)一種重要的細胞器，是蛋白質翻譯后合成、修飾、折疊、分泌以維持細胞功能的重要場所。內(nèi)質網(wǎng)除了參與蛋白質的合成和功能的維持與調節(jié)外，也參與調控脂質的合成與代謝、Ca2+的儲存與釋放、糖類代謝等。內(nèi)質網(wǎng)對于細胞內(nèi)外界環(huán)境的變化非常敏感，當細胞低氧、Ca2+流失或Ca2+超載、糖基化抑制、糖類供應不足，化學藥品紫杉醇(paclitaxel)、衣霉素(tunicamycin) 、毒胡蘿卜內(nèi)酯(thapsigargin)和二硫蘇糖醇(dithiothreitol)等引起的未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白增多時，都可以造成內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失衡從而引發(fā)內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[1]。

ERS一旦發(fā)生，將激活一系列的級聯(lián)反應通路，主要有：未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)，內(nèi)質網(wǎng)超負荷反應(endoplasmic reticulun overload reponse, EOR),固醇調節(jié)級聯(lián)反應,錯誤折疊蛋白轉運至內(nèi)質網(wǎng)介導的蛋白質降解(ER-associated degradation，ERAD)或引發(fā)自噬。其中，UPR和EOR主要由蛋白質加工紊亂所致，而固醇級聯(lián)反應由內(nèi)質網(wǎng)表面合成的膽固醇損耗激發(fā)。目前，研究最為廣泛和透徹的ERS級聯(lián)反應通路為未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)[2]。

1 UPR

在哺乳動物細胞中，UPR主要通過三個內(nèi)質網(wǎng)應激感受器通路減少總蛋白質合成，并通過增強ERAD降解錯誤折疊蛋白。這三條主要的感受器包括：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶(double-stranded RNA-activated protein linase-like, PERK)、活化轉錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)和肌醇需酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)；它們都屬于內(nèi)質網(wǎng)跨膜蛋白，負責將內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)信號傳導至細胞質和細胞核。在正常條件下，內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)的葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein of 78 ku, GRP78)，也稱分子伴侶免疫球蛋白重鏈結合蛋白(heavy chain-binding protein, BIP)，分別與三種感受器結合，形成穩(wěn)定的復合物。當內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白不斷累積，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)與三個感受器競爭GRP78，并與之結合。三個感受器與GRP 78解離后，分別激活各自下游通路，從而引發(fā)相關信號轉導而產(chǎn)生多種細胞調節(jié)[3]。

1.1 IRE1-XBP1IRE1是I型跨膜蛋白，其細胞質內(nèi)區(qū)域具有絲氨酸/蘇氨酸激酶位點和內(nèi)核糖核酸酶活性(RNase)。XBP1是堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)結構蛋白，屬于環(huán)腺苷酸應答元件連接蛋白/激活因子(cyclic AMP response element binding protein/activation factor, CREB/ATF)家族中的一種轉錄因子。當ERS發(fā)生時，IRE1與GRP78解離，形成二聚體或寡聚體，并自磷酸化，隨后啟動了激酶和RNase活性。IRE1活化后，剪切了XBP1的一個含有26個核苷酸的內(nèi)含子，使之成為活化的XBP1s。XBP1s可以進入細胞核內(nèi)與未折疊反應元件結合，從而激活大量的下游靶基因。其中包括：內(nèi)質網(wǎng)降解類似蛋白(ER degradation enhancing alphamannosidase like protein, EDEM),內(nèi)質網(wǎng)應激伴侶分子蛋白，炎性反應，蛋白質二硫化物異構酶(protein desulfide isomerase, PDI)[4]。

1.2 PERKPERK屬I型跨膜蛋白，胞質中存在絲氨酸/蘇氨酸激酶位點。盡管PERK和IRE1在序列上同源性不高，但是在內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)PERK與IRE1結構上有相似性。在功能上，當GRP78與PERK解聚后隨即寡聚化和自磷酸化。磷酸化的PERK激酶活性被激活，可以磷酸化eif2α51位的絲氨酸。eif2α磷酸化后,eif2α、(Met)-tRNA與GTP無法形成三元復合物始動蛋白質的合成，進而導致mRNA的翻譯停止，蛋白質合成受阻滯[4]。

1.3 ATF6ATF6屬于Ⅱ型內(nèi)質網(wǎng)跨膜蛋白，在氨基端具有CREB/ATF bZIP 轉錄因子結構域。當內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)積累未折疊蛋白后，ATF6被GRP78釋放，轉運至高爾基體內(nèi)，被高爾基體膜蛋白酶S1P(site 1 protease)和S2P(site 2 protease)剪切，產(chǎn)生活性片段ATF6p50, ATF6p50隨后進入細胞核，激活下游靶基因的表達。哺乳動物有兩個ATF6同系物，ATF6α和ATF6β。在哺乳動物細胞中，ATF6α可以作為同源二聚體與ERSE結構域啟動子區(qū)結合，反式激活綁定ER分子伴侶基因GRP78或p58IPK。此外，ATF6α也可以與XBP1異源二聚誘導ERAD元件——EDEM、HERP和HRD1的表達[4]。

2 UPR與腫瘤耐藥

ERS發(fā)生后，UPR通路激活并參與調節(jié)多種細胞的病理活動。有研究報道，UPR與多種疾病，諸如代謝綜合征[5]、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病[6-8]、糖尿病、病毒感染性疾病、炎性反應和腫瘤[9]等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。

在快速增殖的腫瘤組織中，腫瘤細胞糖代謝迅速， 實體瘤的生長速度大于其血液供應量， 因此，腫瘤一般處于缺糖、酸中毒及嚴重缺氧狀態(tài)[10]。面對低氧、營養(yǎng)物質耗竭、酸中毒、未允許的基質細胞和細胞外基質交換等這些外界環(huán)境因素的改變，內(nèi)質網(wǎng)通常不能表達正確折疊的蛋白，從而引發(fā)未折疊錯誤折疊蛋白在內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)的蓄積，引發(fā)ERS，激活UPR[11]。UPR的激活在輕度ERS時保護細胞存活，并促進腫瘤細胞向更惡性的方向發(fā)展。因此，UPR可能也是調控腫瘤細胞發(fā)生耐藥性的重要機制之一。

2.1 DNA修復異常引起DNA損傷是很多藥物的作用靶點，很多細胞周期類抗腫瘤藥物，例如，拓撲異構酶抑制劑——依托泊苷、多柔比星；5-氟尿嘧啶、順鉑等都會引起DNA損傷，從而誘導細胞凋亡。但同時，腫瘤細胞內(nèi)也存在抗DNA損傷的修復機制，諸如堿基切除修復、核苷酸切除修復、DNA損傷修復、DNA雙鏈斷裂修復等。這些過程主要由核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等參與完成。當DNA損傷加劇時，這些酶蛋白的合成增加，從而引起DNA修復系統(tǒng)活性異常升高，使得腫瘤細胞獲得耐藥性。近年來的研究表明，UPR有可能通過調控DNA修復，促使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥。Mann等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，UPR可以增強小鼠成纖維細胞對依托泊苷的耐藥性，并直接下調Topoisomerase II α蛋白水平，但是并不影響Topoisomerase IIα的mRNA水平。通過對UPR三條信號轉導通路的進一步研究發(fā)現(xiàn)，IRE 1 通路激活可以在蛋白水平下調Topo IIα表達，但是并沒有改變對依托泊苷的敏感性。說明Topo II α表達的下降可能并不是由于作為XBP-1的下游而受到調控，因為Topo IIα的轉錄并不受ERS影響。相反，PERK激活并沒有改變Topo IIα的蛋白水平，但是該條通路確實在某種程度上對UPR誘導的對依托泊苷的藥物敏感性降低發(fā)揮了重要作用。而ATF6通路與依托泊苷耐藥無明顯相關。Kim等[13]發(fā)現(xiàn)多柔比星可拮抗UPR誘導的細胞凋亡。當多柔比星與thapsigargin聯(lián)合使用處理人乳腺癌MCF-7細胞時，細胞凋亡均少于與單用多柔比星或單用thapsigargin引起的細胞凋亡。此外，多柔比星還可下調ATF4及其下游靶基因CHOP蛋白的表達。但是，同為拓撲異構酶抑制劑的依托泊苷對UPR并無影響，說明多柔比星可能通過其他的通路調節(jié)UPR。Bobrovinkova-marjon等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，PERK通路可以維持細胞處于還原態(tài)，因此可以降低氧化應激誘導產(chǎn)生的ROS引起的DNA損傷，從而維持腫瘤增殖和生長。當PERK干擾沉默后，氧化應激通路被激活，ROS在細胞內(nèi)蓄積，細胞凋亡增加；而過表達PERK后，則細胞凋亡減少。

2.2 凋亡抑制誘導腫瘤細胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細胞的重要機制之一，但腫瘤細胞內(nèi)源性或獲得性的凋亡通路阻斷往往誘發(fā)腫瘤耐藥,造成治療失敗。研究發(fā)現(xiàn)，Bcl/Bax蛋白、核轉錄因子(NF-κB)、p53基因、c-myc基因等都參與調控腫瘤細胞耐藥。研究認為[15-16]，ERS對于細胞凋亡可能具有雙向調節(jié)的作用。在ERS初期，細胞通過上調內(nèi)質網(wǎng)應激伴侶蛋白的轉錄，阻止蛋白積累，短時抑制蛋白翻譯，誘導G1期阻滯，激活大量的轉錄調控通路，增強細胞的降解能力。如果ERS持續(xù)長時間不能緩解，那么將激活相關級聯(lián)通路，啟動凋亡過程。在UPR調節(jié)的抗凋亡機制中，葡萄糖調節(jié)蛋白78——GRP78發(fā)揮了重要的調控作用[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，GRP78在多種腫瘤中高表達，并與腫瘤惡性程度、侵襲轉移和化療藥物耐藥性呈正相關。在乳腺癌中，GRP78只在惡性腫瘤中過表達，但不在良性乳腺病變中表達。這可能是在腫瘤組織中，由于血管分布不均、腫瘤細胞代謝迅速，而比正常細胞表現(xiàn)出更高的葡萄糖利用率有關。Ranganathan等[19]發(fā)現(xiàn)p38可以激活靜止期細胞啟動存活前機制。這是通過上調GRP78表達并激活PERK通路，使休眠細胞獲得對毒性藥物的抗性。此外，GRP78的上調也可以阻止Bax的激活，進而引起休眠細胞耐藥。Jiang等[20]證實，GRP78可以與Caspase-4特異結合，而通過給予MEK/ERK通路靶向抑制劑U1026或MEK1 siRNA可以下調GRP78表達，從而誘導Caspase-4激活，啟動Caspase-9、Caspase-3級聯(lián)反應線粒體凋亡通路，最終導致細胞凋亡。此外，除了Caspase-4還有文獻[21]報道稱, GRP78可以與BIK結合，GRP78過表達可抑制BIK和雌激素——饑餓誘導的BAX激活；而通過siRNA干擾沉默GRP78可以增加乳腺癌細胞通過雌激素饑餓誘導的凋亡。此外，也有文獻報道[22]，BAG3可通過直接與GRP78作用，增強DNA損傷劑對腫瘤細胞的殺傷作用。

2.3 自噬自噬是指真核細胞質內(nèi)的大分子物質及細胞器被運送至溶酶體隔離并降解的過程。自噬是在正常細胞核病理狀態(tài)細胞中普遍存在的生理機制，尤其是在細胞內(nèi)和/或細胞外應激的情況下，例如缺氧、營養(yǎng)匱乏、蛋白質折疊、病原菌感染時，一方面細胞通過自噬獲得可供循環(huán)利用的核苷、氨基酸等大分子物質及能量，維持細胞代謝平衡，另一方面還可選擇性地清除某些細胞成分，尤其是受損或多余的過氧化物酶、內(nèi)質網(wǎng)、線粒體及DNA，減少異常蛋白和細胞器的堆積，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。自噬作為一種保護措施，維持細胞生存的同時，也與細胞的死亡密切相關。自噬與凋亡作為細胞啟動程序性死亡的兩個方面有著密切的聯(lián)系。近年來的研究表明[23-25]，在多種腫瘤細胞中，化療藥物在誘導細胞凋亡的同時也能誘導細胞自噬，與凋亡必然導致腫瘤細胞死亡的作用不同，自噬的發(fā)生既能作為保護腫瘤細胞抑制凋亡的生存機制，也能與凋亡共同參與細胞死亡的誘導。而腫瘤發(fā)生的保護性自噬可能是細胞耐藥性產(chǎn)生的潛在的重要機制之一。

近年的研究結果提示，ERS通過UPR通路誘導自噬，而真核細胞通過自噬可以將胞內(nèi)的大分子物質及細胞器分解，以便重復利用。Li等[26]發(fā)現(xiàn)，GRP78是內(nèi)質網(wǎng)應激誘導的自噬的重要因素。當SiRNA干擾沉默GRP78后，可自發(fā)激活UPR通路，并促進LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉換，但是由ERS誘導形成自噬小體的能力卻被抑制。此外，PI3KC3抑制劑3-methyladenine (3-MA)，也可以同時抑制ERS誘導的自噬和UPR通路。Qu等[27]發(fā)現(xiàn)一種姜黃素單羰基類似物——B19，可通過抑制ERS誘導的自噬，減弱自噬對細胞的保護作用，從而增加ERS相關UPR通路誘導的凋亡。H?yer-Hoyer-Hansen等[28]的研究認為，PERK、IRE1和Ca2+濃度的增加是ERS誘導自噬的調節(jié)因子。

3 結語

腫瘤是當今世界最難治愈的疾病之一，而腫瘤細胞對于放化療治療產(chǎn)生的耐藥性也是腫瘤臨床治療中急需解決的重大問題。上世紀ERS的概念提出后，科學家們對此領域進行了廣泛的研究，對ERS和UPR反應的認識逐漸深入。目前研究認為，UPR的三條通路PERK、IRE1和ATF6調控細胞存活或凋亡的生物學功能不盡相同，進而對下游通路調節(jié)的生物學功能如DNA修復異常、凋亡抑制、自噬等的影響也存在差異。介導內(nèi)質網(wǎng)應激與腫瘤耐藥的機制并沒有完全研究清楚。但是，隨著研究的繼續(xù)深入，針對UPR下游三條通路的靶向抑制劑的進一步研究與開發(fā)，將會有望成為治療癌癥放化療耐藥提供有效的靶點。

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Correlations of endoplasmic reticulum stress and cancer drug resistance

YAN Yuan-yuan, HE Miao, WEI Ming-jie

(DeptofPharmacology,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110000,China)

Endoplasmic reticulum is an important organelle in eukaryotic cells. Endoplasmic reticulum stress(ERS) is usually triggered under cell hypoxia, carbohydrate undersupply or medical treatment. Now, present studies show that ERS could activate several cell signal pathways and the UPR pathway is most widely researched. When UPR activates cell signal pathway, it can regulate cancer drug resistance by involving with DNA damage repair, apoptotic suppression and autophagy.

endoplasmic reticulum stress; cancer drug resistance; UPR; ERS; apoptotic suppression; autophagy

時間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.009.html

2014-10-31,

2014-12-16

國家自然科學基金資助項目(No 81373427)；遼寧省自然科學基金資助項目(No 2014021085)

顏媛媛(1987-)，女，博士，研究方向:分子腫瘤藥理學, E-mail:yanyuanyuan1987@163.com; 魏敏杰(1963-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：分子腫瘤藥理學，E-mail:weimingjiecmu@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.005

A

1001-1978(2015)04-0461-04

R329.24；R329.25；R730.53