從靶標(biāo)到網(wǎng)絡(luò)
——抗菌藥物作用機(jī)制與細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

陳代杰

·綜述·

從靶標(biāo)到網(wǎng)絡(luò)
——抗菌藥物作用機(jī)制與細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

陳代杰

細(xì)菌耐藥機(jī)制； 抗菌藥物； 靶標(biāo)； 網(wǎng)絡(luò)

細(xì)菌耐藥性是21世紀(jì)威脅人類生命健康的最重要元兇之一。傳統(tǒng)的細(xì)菌耐藥機(jī)制主要有：①抗菌藥物的選擇壓力，使極少量的耐藥菌可繼續(xù)生長繁殖；②抗菌藥物可誘導(dǎo)高突變細(xì)菌（hyperm utator）發(fā)生某些基因的突變；③敏感菌通過接受外源帶有耐藥基因的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等載體的橫向傳遞，成為耐藥菌［1-3］。但這些 無法完全 解釋當(dāng) 前 臨床 耐 藥菌的廣泛傳播以及大量細(xì)菌性感染患者治療失敗的原因。近年來，對細(xì)菌接觸亞致死劑量抗菌藥物后細(xì)菌內(nèi)部“網(wǎng)絡(luò)”變化的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制，除已發(fā)現(xiàn)的特異性“靶標(biāo)”這一經(jīng)典理論外，更深入的還與細(xì)菌蛋白網(wǎng)絡(luò)的變化有關(guān)：某些蛋白的變化導(dǎo)致相應(yīng)代謝途徑的變化，“代謝網(wǎng)路”的變化與細(xì)菌耐藥性直接相關(guān)［4］。

亞致死劑量的抗菌藥物不僅存在于藥物治療期的細(xì)菌感染患者中，更存在于人類生活的環(huán)境中，如被殘留抗菌藥物污染的水體、土壤和食物［5］。細(xì)菌接觸亞劑量抗菌藥物后受到選擇壓力的作用會引起自身基因隨機(jī)突變，繼而導(dǎo)致一系列基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的改變，以此來抵御環(huán)境壓力。這是目前引起細(xì)菌耐藥性傳播和泛濫的主要原因，也是臨床 治 療失 敗 的主 要 原因［1，6-7］。

近年來基于蛋白組學(xué)的“細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”研究，打開了一扇能夠看到細(xì)菌接觸抗菌藥物后引起內(nèi)部變化的窗戶。而更深層次的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)耐藥機(jī)制研究需要借助基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等技術(shù)來了解細(xì)胞內(nèi)的“微觀變化”，同時結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等方法，聯(lián)系組學(xué)研究揭示的“微觀變化”與細(xì)菌耐藥性的“宏觀特征”，從中發(fā)現(xiàn)造成耐藥性的“關(guān)鍵推手”。深入的機(jī)制研究將在新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)、尋找新型抗菌藥物以及新的生物標(biāo)志物、為新的臨床治療手段提供科學(xué)依據(jù)等方面有所助益，意義重 大［8-10］。

1 抗菌藥物是如何殺滅細(xì)菌的：從靶標(biāo)到網(wǎng)絡(luò)

半個多世紀(jì)以來，人們對抗菌藥物作用靶標(biāo)的研究取得了很大進(jìn)步。目前，幾乎所有臨床應(yīng)用的半合成抗生素都是基于靶標(biāo)特異性而研發(fā)成功的，而天然產(chǎn)物抗生素的發(fā)現(xiàn)并非基于靶標(biāo)，它們往往是基于一般的抗菌活性篩選所得。目前典型的抗菌藥物特異性作用靶標(biāo)包括：細(xì)胞壁（β內(nèi)酰胺類和糖肽類）、細(xì)胞膜（脂肽類）、D N A或R N A（喹諾酮類和利福霉素類）、50S核糖體（大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺、鏈陽性菌素類）、30S核糖體（氨基糖苷類和氯霉素類），以及葉酸合成（磺胺類）等［11］。

隨著對抗菌藥物作用機(jī)制和細(xì)菌耐藥機(jī)制研究的深入，人們認(rèn)識到：一個細(xì)菌就是一個生命的整體。一個生命體在遭遇環(huán)境變化時，除了具有特殊的應(yīng)對機(jī)制外（即靶標(biāo)特異性），更多的是調(diào)動生命體的整個蛋白網(wǎng)絡(luò)來應(yīng)對外界刺激和壓力。這種蛋白網(wǎng)絡(luò)的變化或是導(dǎo)致細(xì)菌死亡，或是提高細(xì)菌抵御抗菌藥物壓力繼而導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。這正是近年來愈來愈多的抗菌藥物作用機(jī)制和細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究由“靶標(biāo)”轉(zhuǎn)向到“網(wǎng)絡(luò)”的原因所在［4］。

近年來，以Collins研究團(tuán)隊(duì)為代表的“網(wǎng)絡(luò)性”抗菌藥物作用機(jī)制研究取得了突破性進(jìn)展。其中一個重要的發(fā)現(xiàn)是殺菌性抗菌藥物如：D N A促旋酶抑制劑喹諾酮類、30S核糖體抑制劑氨基糖苷類，以及細(xì)胞壁合成抑制劑β內(nèi)酰胺類抗生素在與各自的作用靶位結(jié)合后，觸發(fā)三羧酸（T C A）循環(huán)中的N A D（P）H的瞬間損耗、鐵-硫簇（Fe-S cluster）的不穩(wěn)定以及刺激芬頓（Fenton）反應(yīng)，由此產(chǎn)生大量的羥基自由基（·O H），最終呈現(xiàn)一個 共同的 殺菌機(jī)制——·O H對細(xì)菌D N A、蛋白以及脂類等的損傷而 導(dǎo) 致細(xì) 菌死 亡［12-15］。Grant等［16］研究 表 明：在液體培養(yǎng)恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌時，提高氧飽和度能夠顯著提高氧氟沙星和異煙肼誘導(dǎo)的·O H的產(chǎn)生，進(jìn)而有效地消除對抗菌藥物耐受的持留菌的生長。這種由細(xì)菌接觸殺菌性抗菌藥物后觸發(fā)的·O H殺菌機(jī)制，也呈現(xiàn)在殺菌性抗真菌藥物兩性霉素B、咪康唑類藥物，以及環(huán)吡類藥物對白念珠菌和釀酒酵母的殺菌過程中［17］。同時，長期使用這類殺菌性抗菌藥物也能夠誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)·O H含量增加，以及造成哺乳動物細(xì)胞線粒體的功能障礙［18］。這一重要發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究開發(fā)具有增效細(xì)菌接觸殺菌性抗菌藥物后產(chǎn)生·O H，提高殺菌能力的輔助抗菌藥物提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)踐的可能性［19-20］。

但是，最近 Liu等［21］、Keren等［22］，以及Ezraty等［23］3個獨(dú)立的研究小組相繼在Science上發(fā)表了他們不同的研究結(jié)果，對Collins等提出的殺菌性抗菌藥物基于產(chǎn)生活性氧自由基（R O S）的普遍殺菌機(jī)制提出了質(zhì)疑。這為學(xué)術(shù)界進(jìn)一步深入研究抗菌藥物的作用機(jī)制注入了新的活力。除了以上結(jié)果外，大量研究還表明β內(nèi)酰胺類抗生素和喹諾酮類抗菌藥物引起細(xì)菌死亡的另一個重要原因是，細(xì)菌接觸這類抗菌藥物后產(chǎn)生的8-氧代-脫氧鳥苷損傷難以修復(fù)而致使 D N A的斷裂所致；而氨基糖苷類抗生素可能還附加有8-氧代-脫氧鳥苷摻入到R N As后，引起翻譯錯誤導(dǎo)致細(xì)菌死亡的因素［24］，由此補(bǔ)充了殺菌性抗菌藥物觸發(fā)的·O H的共同殺菌機(jī)制。殺菌性抗菌藥物能夠誘導(dǎo)大腸埃希菌與凋亡有關(guān)的網(wǎng)絡(luò)變化，即在細(xì)菌的死亡進(jìn)程中呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的特征：磷脂酰絲氨酸的暴露、染色體凝聚、以及D N A斷裂［25］。Allison等［26］研究 表 明，甘露 糖 等 物 質(zhì) 能夠通過細(xì)菌代謝產(chǎn)生質(zhì)子驅(qū)動力，幫助氨基糖苷類抗生素進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi)，從而有效地清除“持留菌”。W aka m oto等［27］的研究發(fā)現(xiàn)，致死劑量異煙肼孵育下的恥垢分枝桿菌后期持留菌的消除與單個細(xì)胞中隨機(jī)表達(dá)過氧化物酶（KatG）相關(guān)，該酶能夠催化N A D H與藥物發(fā)生共價修飾，進(jìn)而阻斷細(xì)菌分支酸的合成和導(dǎo)致死亡。

2 細(xì)菌耐藥性的發(fā)生、發(fā)展和傳播：從靶標(biāo)到網(wǎng)絡(luò)

長期以來抗菌藥物被廣泛的用于人、各種牲畜和水生動物的抗感染治療，大量的殘留抗菌藥物隨著工業(yè)和醫(yī)療含抗菌藥物殘留廢棄物，人與動物糞便以及水產(chǎn)養(yǎng)殖水體流入環(huán)境，致使耐藥菌的泛濫和傳播，最終導(dǎo)致耐藥菌感染患者的治療失敗。這種宏觀間的因果聯(lián)系早已被人們接受，但是這種聯(lián)系已經(jīng)無法完全用早期的抗菌藥物選擇壓力理論［28］、抗菌藥物作用靶標(biāo)的改變致使親和力降低理論、以及細(xì)菌產(chǎn)生特異性的酶破壞抗菌藥物等傳統(tǒng)的耐藥機(jī)制來解釋，也無法簡單用傳統(tǒng)的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的機(jī)制來解釋耐藥菌的快速蔓延和傳播［29］。本世紀(jì)臨床面臨的一大挑戰(zhàn)是如何征服日趨嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性：今天不采取行動，明天就無藥可用［30］。而近年來學(xué)術(shù)界大量有關(guān)細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究成果，無疑是人類征服細(xì)菌耐藥性的強(qiáng)大基石。

2.1 亞致死劑量抗菌藥物引起的可遺傳細(xì)菌耐藥性：特異性靶標(biāo)的突變

從遺傳角度，基本上可以把細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性分為可遺傳和不可遺傳2種?？蛇z傳的耐藥菌包括組成型和誘導(dǎo)型，其耐藥機(jī)制往往直接與抗菌藥物及其作用靶位有關(guān)，這些傳統(tǒng)的細(xì)菌耐藥機(jī)制包括：①細(xì)菌細(xì)胞膜上孔蛋白的改變阻止藥物進(jìn)入胞內(nèi)；②外排泵蛋白對已經(jīng)進(jìn)入胞內(nèi)藥物的排出作用；③鈍化（修飾或水解）酶對抗菌藥物的滅活；④抗菌藥物作用靶標(biāo)的改變阻止藥物的結(jié)合；⑤改變藥物作用靶標(biāo)的代謝途徑等［29］。在高劑量抗菌藥物選擇壓力下，細(xì)菌因誘導(dǎo)突變對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥而從敏感菌群體中選擇出來；同樣，細(xì)菌在接觸低劑量（亞致死劑量）的抗菌藥物后，也會使部分敏感 菌 發(fā)生 隨 機(jī)的 自 發(fā) 突變 而 成為耐 藥 菌［2，31-32］。 已有大量研究表明，盡管已上市的抗菌藥物對哺乳動物沒有“致癌、致畸和致突變”的作用，但β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和喹諾酮類等殺菌性抗菌藥物卻都能引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性突變［33］。氨芐西林、卡那霉素和諾氟沙星能夠通過誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生·O H來提高對多種結(jié)構(gòu)類別的抗菌藥物的耐受。其中氨芐西林能夠引起大腸埃希菌的促旋酶 A和B基因（gry A和gryB）或是acrA B啟動子pacrA B基因的突變，從而對諾氟沙星產(chǎn)生耐藥；氨芐西林也能夠引起核蛋白 RpsL 的突變，從而對卡那霉素產(chǎn)生耐藥［4］。Nair等［34］的研究 顯示，β內(nèi)酰 胺類、氨基 糖苷 類和喹諾酮類抗菌藥物能夠引起銅綠假單胞菌對利福霉素耐受的突變頻率。Toprak 等［35］利用氯霉素、金霉素和甲氧芐啶等抗菌藥物壓力連續(xù)培養(yǎng)大腸埃希菌20 d后，其對抗菌藥物的耐受性大幅提高。然后對這些耐藥性大幅提高的菌株進(jìn)行全基因組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些突變既有對藥物的特異性，也有多藥耐藥的突變發(fā)生。

愈來愈多的研究顯示，即使極低劑量的抗菌藥物，也能夠有效地富集高度耐藥的細(xì)菌，即抗菌藥物可以作為誘變劑致使高突變細(xì)菌（hyperm utator）接觸后發(fā)生某些基因的突變，造成對藥物的耐受［3］。這一發(fā)現(xiàn)可以部分解釋細(xì)菌耐藥性快速傳播和擴(kuò)散的原因——細(xì)菌接觸亞致死劑量抗菌藥物后導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥性突變。而細(xì)菌接觸亞致死劑量抗菌藥后引起的蛋白網(wǎng)絡(luò)變化，更是導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥性發(fā)展的重要原因。

2.2 亞致死劑量抗菌藥物引起的不可遺傳細(xì)菌耐藥性：蛋白網(wǎng)絡(luò)變化的耐藥機(jī)制

所謂不可遺傳的耐藥，即由“環(huán)境”引起（環(huán)境依賴型）的對抗菌藥物產(chǎn)生“非遺傳”性的耐藥菌，通常被稱之為“持留菌（persisters）”，即非傳統(tǒng)意義上的“抗性（resistance）”而是“持留性（persistence）”，但無論是抗性還是持留性，其對抗菌藥物都表現(xiàn)出一定程度的耐受（tolerance），宏觀上都表現(xiàn)為耐藥。持留菌是目前臨床上細(xì)菌感染治療失敗的主要原因 ［36-38］。

2.2.1 S O S與細(xì)菌耐藥性（持留性） 研究表明，細(xì)菌為了適應(yīng)不同壓力環(huán)境會根據(jù)不同生存環(huán)境選擇性地表達(dá)或阻抑某些基因。由S O S介導(dǎo)的遺傳網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)是導(dǎo)致細(xì)菌在抗菌藥物壓力下適應(yīng)性生存的主要策略。S O S反應(yīng)作為一種可誘導(dǎo)的D N A修復(fù)和損傷耐受體系，是細(xì)菌對 D N A 損傷的應(yīng)激反應(yīng)。RecA阻遏蛋白和Lex A誘導(dǎo)蛋白在調(diào)節(jié)S O S中起主要作用。S O S系統(tǒng)至少編碼40個以上的蛋白，用于D N A的保護(hù)、修復(fù)、復(fù)制、致突變以及代謝［］。

殺菌性抗菌藥物具有誘導(dǎo)產(chǎn)生·O H 的共同殺菌途徑?！ H 在破壞細(xì)菌D N A 的同時，損傷的D N A能夠誘導(dǎo)S O S反應(yīng)。S O S反應(yīng)增強(qiáng)了細(xì)菌修復(fù)損傷D N A的能力，弱化抗菌藥物的影響，即產(chǎn)生細(xì) 菌 耐藥性［15，40］。 大 腸 埃 希 菌 接 觸 喹 諾 酮類 抗菌藥物氧氟沙星后所出現(xiàn)的“持留菌”，依賴于細(xì)菌接觸抗菌藥物后S O S網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的激活，此發(fā)現(xiàn)打破了細(xì)菌接觸抗菌藥物后產(chǎn)生的持留菌是隨機(jī)形成的觀點(diǎn)［41］。Cirz等［42］研究發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類通過誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌（金葡菌）的S O S系統(tǒng)，活化產(chǎn)生毒素蛋白TisB，插入到細(xì)胞膜后引起陽離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而擾亂質(zhì)子驅(qū)動力，最終導(dǎo)致敏感菌成為持留菌。但過度表達(dá)毒素蛋白TisB，則會導(dǎo)致細(xì)菌的大量死亡 ［43］。

S O S介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥性的另一個重要機(jī)制是參與耐藥基因的水平傳遞。Beaber等［44］研究發(fā)現(xiàn)，氧氟沙星能夠通過S O S對 D N A損傷的響應(yīng)，導(dǎo)致減輕SetR蛋白對S X T（氯霉素、磺胺甲口惡唑、甲氧芐啶和鏈霉素的耐藥基因）的阻遏；促進(jìn)SX T的轉(zhuǎn)移。G uerin等［45］的研究表明，甲氧芐啶、喹諾酮類和β內(nèi)酰胺類抗菌藥物能夠通過誘導(dǎo)S O S，促進(jìn)整合酶的表達(dá)。而在革蘭陰性菌中，編碼大多數(shù)抗生素（如β內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類）可傳遞的耐藥基因通常被攜帶在1型整合子上，而這一耐藥基因傳遞整合至 另 一受體細(xì)菌中需要整 合 酶。Ca m bray等［46］的研究表明，當(dāng)S O S表達(dá)阻遏蛋白 Lex A 受到外界壓力（如抗菌藥物）去阻遏后，該蛋白通過與大腸埃希菌樣的Lex A結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而調(diào)控整合酶的表達(dá)，整合外源帶有耐藥基因的整合子到細(xì)菌染色體上，為進(jìn)一步闡明S O S系統(tǒng)與耐藥基因水平傳遞的精細(xì)機(jī)制打下了基礎(chǔ)。H ocquet［47］等研究發(fā)現(xiàn)：在法國某醫(yī)院的銅綠假單胞菌流行的原因，是由于第1例感染該細(xì)菌的患者不合理地用了甲硝唑治療的緣故，因?yàn)榧?xì)菌接觸甲硝唑后促發(fā)了S O S的響應(yīng)，進(jìn)而活化了整合酶基因（IntI1）的表達(dá)，最終導(dǎo)致所有β內(nèi)酰胺酶的表達(dá)，并在整個醫(yī)院內(nèi)擴(kuò)散。

2.2.2 （p）ppGpp與細(xì)菌耐藥性 微生物能感知環(huán)境 脅 迫 信 號，通 過觸 發(fā) 嚴(yán)謹(jǐn) 反 應(yīng)（stringent response）對生長速率進(jìn)行調(diào)節(jié)，即當(dāng)營養(yǎng)缺乏時，pp Gpp調(diào)節(jié)引起嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，細(xì)胞停止了大部分代謝活動，僅保留維持生存的必需代謝活動，R N A 含量下降，使細(xì)胞能在不利環(huán)境中生存。高度磷酸化的鳥苷四/五磷酸（pp Gpp/ppp Gpp）作為信號分子對微生物生理具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，pp G pp介導(dǎo)的全局性調(diào)控對逆境生存起到了重要作用［48-49］。

近年來，有關(guān)pp Gpp調(diào)控細(xì)菌耐藥性發(fā)生的機(jī)制被逐步揭示。Po mares等［50］研究發(fā)現(xiàn)，R N A 聚合酶 （R N A P）是多種抗生素的作用靶標(biāo)，其中包括多肽抗生素小菌素J25（microcin）。敏感型大腸埃希菌在小菌素的環(huán)境中，進(jìn)入靜止生長期的細(xì)菌對抗生素的敏感性顯著下降，而ppG pp顯著上升。其主要作用機(jī)制推測有2個：①ppG pp占據(jù)了 R N A聚合酶附近的活性靶位，并與 R N A聚合酶核心酶的β亞基和β′亞基發(fā)生交互作用，以及作為變構(gòu)因子阻止了抗生素與R N A P靶標(biāo)的結(jié)合；②ppG pp作為全局性調(diào)控因子，顯著上調(diào)了特異性小菌素外排蛋白Yojl，使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的抗生素濃度顯著下降，從而保護(hù)細(xì)菌免遭殺害。這類抗生素還有利福霉素、m yxopyronin、corallopyronin，以及 ripostatin等。A branches等［51］研究發(fā)現(xiàn)，用莫匹羅星處理糞腸球菌后，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ppGpp含量大幅上升，且這種積累與細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白、堿休克蛋白，以及細(xì)菌對萬古霉素的耐受性成正相關(guān)性。M wangi等［52］通過對金葡菌的全基因組測序分析揭示了細(xì)菌對β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性與ppG pp合成酶（RelA）表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)。但是，在大腸埃希菌接觸亞致死劑量的卡那霉素后，與ppG pp合成酶（RelA）的關(guān)系不大，而與另一個與ppG pp合成有關(guān)的水解酶基因spoT 關(guān) 系較 大［53-54］。最 近 ，M aisonneuve等［55］研 究發(fā)現(xiàn)，持留菌的產(chǎn)生與細(xì)胞中無機(jī)多聚磷酸酯酶呈正相關(guān)；這種多聚磷酸酯酶與Lon蛋白一起活化毒素-抗毒素系統(tǒng)；導(dǎo)致大腸埃希菌K-12中11種抗毒素降解；然后觸發(fā)毒素蛋白的翻譯，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長。

2.2.3 營養(yǎng)代謝與細(xì)菌耐藥性 營養(yǎng)饑餓能夠引起細(xì)菌對抗菌藥物產(chǎn)生耐受，其主要機(jī)制是由于環(huán)境缺乏營養(yǎng)而介導(dǎo)細(xì)菌生長停滯，從而導(dǎo)致抗菌藥物作用靶 位的鈍 化［56］。N guyen 等［57］研究 發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)缺乏環(huán)境下銅綠假單胞菌主動啟動饑餓信號嚴(yán)謹(jǐn)型響應(yīng)機(jī)制（而不是由于饑餓而被動地使細(xì)菌停滯生長的過程），減緩細(xì)菌接觸抗菌藥物后產(chǎn)生的氧化壓力，進(jìn)而減少了氧化壓力對細(xì)菌菌膜破壞作用，由此細(xì)菌能夠在抗菌藥物壓力下生長繁殖。H offman等［58］研究發(fā)現(xiàn)，囊性纖維化氣道中的銅綠假單胞菌在缺氧和富有硝酸鹽的條件下對妥布霉素和環(huán)丙沙星的耐受性提高。

2.2.4 細(xì)菌耐藥機(jī)制的多樣性 細(xì)菌接觸抗菌藥物后引起的抗性具有多樣性反應(yīng)。如 Fuller等［59］研究發(fā)現(xiàn)，雖然金葡菌 A T C C 9144不存在青霉素酶和PBP2a，但仍然表現(xiàn)出對青霉素G較高的耐藥性；其主要機(jī)制是細(xì)菌接觸β內(nèi)酰胺類抗生素后引起的瞬時細(xì)胞壁的不完整性所介導(dǎo)，且隨后細(xì)胞壁恢復(fù)正常的細(xì)胞對抗菌藥物的耐藥性是可以遺傳的。對金葡菌耐受達(dá)托霉素的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，耐藥菌的細(xì)胞膜發(fā)生一系列變化，如流動性降低、總賴氨酰-磷脂酰甘油（L P G）合成增加、LP G 翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜外雙層增加，以及負(fù)責(zé)增加表面電荷的基因dlt表達(dá)增加［60］。Perron等［61］對多株 亞胺 培 南耐藥 突變株的分析發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞膜上抗菌藥物特異性孔蛋白OprD的水平大幅降低，這與雙組分蛋白CzcRCzcS發(fā)生變異有關(guān)。Aiassa等［62］用亞致死劑量的氧氟沙星處理奇異變形桿菌突變株后，篩選得到4株對氧氟沙星具有不同耐受程度的突變株。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通常造成細(xì)菌耐藥性的促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶典型位點(diǎn)并沒有發(fā)生突變，而細(xì)胞內(nèi)三價鐵的還原抗氧化能力大幅提高。最后驗(yàn)證細(xì)菌對抗菌藥物的耐受性主要由抗氧化能力的提高所致。Begley等［63］研究發(fā) 現(xiàn)，單核 細(xì) 胞增 生 李斯特 菌（Listeria monocytogenes）中的谷氨酸脫羧酶的活性，與細(xì)菌對多肽類抗生素乳鏈球菌素的耐受性相關(guān)。Lee等［64］研究發(fā)現(xiàn)，敏感細(xì)菌群體耐藥性的發(fā)生可以通過極個別耐藥菌提供的“慈善”（charity w ork）獲得。在液體連續(xù)培養(yǎng)器中用逐步提高諾氟沙星濃度的方法，“孵育”（incubation）敏感性大腸埃希菌10 d，然后分離這些在高抗菌藥物壓力下生長的細(xì)菌，進(jìn)行抗性平皿篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有極個別的細(xì)菌能夠在與液體培養(yǎng)過程中相同濃度的諾氟沙星下生長，進(jìn)一步研究顯示正是這些個別耐藥菌產(chǎn)生的吲哚化合物“分享”（share）給了敏感菌所致。因?yàn)榻?jīng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析和分子生物學(xué)驗(yàn)證，吲哚類物質(zhì)能夠誘導(dǎo)細(xì)菌藥物外排泵的表達(dá)，以及啟動氧化壓力的保護(hù)機(jī)制。G usarov等［65］和 Shatalin等［66］研究分別發(fā)現(xiàn)，很多病原菌產(chǎn)生的內(nèi)源性 N O 和H2S能夠通過減緩由各種結(jié)構(gòu)類別的殺菌性抗菌藥物引起的氧化壓力，從而產(chǎn)生耐藥性。

Jia等［67］的研究揭示了細(xì)菌產(chǎn)生氨基糖苷類鈍化酶的新機(jī)制：氨基糖苷類抗生素進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi)后，與細(xì)菌核糖體開關(guān)（riboswitch）結(jié)合，從而引起一系列變化：編碼鈍化酶的m R N A二級結(jié)構(gòu)的改變→核糖體結(jié)合序列的暴露→核糖體與m R N A 結(jié)合→鈍化酶的翻譯→將活性抗生素分子鈍化→抗菌藥物與30S核糖體親和力下降，最終導(dǎo)致細(xì)菌對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。本發(fā)現(xiàn)的最新成果是揭示了抗菌藥物小分子能夠直接調(diào)控蛋白質(zhì)（氨基糖苷鈍化酶）的翻譯。Kannan等［68］研究揭示了細(xì)菌之所以在接觸極高致死劑量的紅霉素和泰利霉素后，仍然具有合成蛋白（多肽）能力的機(jī)制：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素結(jié)合于細(xì)菌50S rR N A 中的23S rR N A，只是部分阻塞新生肽排出隧道（nascentpeptide exit tunnel，N P E T），因而細(xì)菌即使接觸極高致死劑量的抗菌藥物，細(xì)菌在短時間內(nèi)還是能夠選擇性地合成蛋白或多肽。這些最新的重大研究成果，為認(rèn)識抗菌藥物的作用機(jī)制和細(xì)菌耐藥機(jī)制提供了新的思路。

越來越多的研究表明，細(xì)菌耐藥性的發(fā)生、發(fā)展、擴(kuò)散和傳播有著極其多樣性的機(jī)制，這種由表及里，由淺到深的基礎(chǔ)研究成果，最終必將會給新型抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)帶來新的希望：特別是如何改變通過“與細(xì)菌正面交鋒的策略——抑制細(xì)菌生長所必需的途徑”，以避免“道高一尺，魔高一丈”的局面；轉(zhuǎn)向如何解除細(xì)菌耐藥的“武器裝備”的策略——發(fā)現(xiàn)像β內(nèi)酰胺酶抑制劑等不影響細(xì)菌生長的抗菌增效劑；同時，這種基礎(chǔ)研究成果也必將會對臨床診斷生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)協(xié)同“抗菌作戰(zhàn)”的新型輔助藥物的發(fā)現(xiàn)、新型臨床治療方案的設(shè)計，乃至新型細(xì)菌耐藥性控制策略的制定帶來新的希望。

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From target to network：research updates on the mechanisms of antimicrobial action and bacterial resistance

C H E ND aijie. （ChinaStateInstituteofP harm aceuticalIndustry，Shanghai Instituteof P harm aceutical Industry，State Key Laboratory of N ew Drug&P harm aceutical Process，Shanghai 200040，China）

R966

A

1009-7708（2015）01-0084-07

2014-03-25

2014-07-01

2013年國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273413）；2014年國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81373310）。

中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海 200040。

陳代杰（1957—），男，博士，研究員，主要從事抗微生物藥物開發(fā)。

陳代杰，E-mail：hccb001@163.co m。