探索運(yùn)用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋零的方法

李青鞠

（河南省濮陽(yáng)市濮陽(yáng)油田總醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 濮陽(yáng) 457001）

探索運(yùn)用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋零的方法

李青鞠

（河南省濮陽(yáng)市濮陽(yáng)油田總醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 濮陽(yáng) 457001）

目的 探討運(yùn)用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋零的方法。方法 以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量、磷酯酰絲氨酸、線粒體膜電位、鈣離子濃度，對(duì)凋零細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果 DNA含量檢測(cè)敏感度、特異性欠佳；磷酯酰絲氨酸測(cè)定對(duì)細(xì)胞凋零的早期、晚期情況可做出良好反應(yīng)；線粒體膜電位、鈣離子濃度可反應(yīng)出細(xì)胞凋零時(shí)的生理指標(biāo)。結(jié)論 每種檢測(cè)方法均存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)，在使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋零時(shí)，應(yīng)具有針對(duì)性的檢測(cè)方法進(jìn)行選擇，提高檢測(cè)效率。

流式細(xì)胞儀；細(xì)胞凋零；DNA含量；磷酯酰絲氨酸；線粒體膜電位

細(xì)胞凋零又稱(chēng)為細(xì)胞程序性死亡，細(xì)胞凋零時(shí)，往往伴有形態(tài)變化及生化改變。了解細(xì)胞凋零過(guò)程對(duì)于維持機(jī)體的正常發(fā)育、促進(jìn)新陳代謝是具有重要意義的，細(xì)胞凋零是具有一項(xiàng)正向意義的機(jī)體內(nèi)部活動(dòng)［1］。但由于細(xì)胞凋零與細(xì)胞壞死之間存在大量的相似點(diǎn)，因此，了解一個(gè)細(xì)胞具體的凋零過(guò)程是十分有必要的。目前，常通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋零的過(guò)程，該種儀器可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量分析和分選。在此次調(diào)查中，筆者主要從測(cè)定DNA含量、磷酯酰絲氨酸、線粒體膜電位、鈣離子濃度等方面來(lái)了解細(xì)胞凋零過(guò)程中所發(fā)生的一系列生化改變特性，并篩選出檢測(cè)細(xì)胞凋零的最適方法。具體情況如下。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由上海博古生物提供，脂多糖由Sigma公司生產(chǎn)提供，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋零檢測(cè)試劑盒由Roch公司生產(chǎn)提供，JC-1、羅丹明123膜電位檢測(cè)試劑盒由碧云天公司生產(chǎn)提供，F(xiàn)ulo-3鈣離子濃度檢測(cè)試劑盒由碧云天公司生產(chǎn)提供。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)方法：此次試驗(yàn)主要通過(guò)DMEM/F12培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)直至融合。細(xì)胞消化傳代使用1.25 g/L胰酶，并從中選擇生長(zhǎng)良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的設(shè)定：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中加入20 mg/L的LPS，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行一段時(shí)間的刺激。對(duì)照組細(xì)胞中不加入藥物，使兩組細(xì)胞的最終培養(yǎng)濃度為5×105個(gè)/mL。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1DNA含量測(cè)定：以PBS對(duì)胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行洗滌，通常洗滌2次，后收集細(xì)胞。加入預(yù)冷70%的乙醇溶液，于4 ℃恒溫環(huán)境下放置過(guò)夜。離心法收集所需細(xì)胞，并加入50 μg/mL的溴化乙錠及100 μg/mL的RNaseA，在4 ℃環(huán)境中避光培養(yǎng)30min后以流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)。

1.4.22磷脂結(jié)合蛋白AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)法：以PBS對(duì)胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行洗滌，通常洗滌2次，后收集細(xì)胞。于細(xì)胞內(nèi)加入經(jīng)FITC所標(biāo)記的AnnexinV，并在室溫環(huán)境下避光培養(yǎng)30min。后加入PI，于避光環(huán)境下再次培養(yǎng)反應(yīng)5min。最后加入Buffer（加入量根據(jù)細(xì)胞量確定）并以流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)。

1.4.3線粒體膜電位檢測(cè)：以PBS對(duì)胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行洗滌，通常洗滌2次，后收集細(xì)胞。以濃度為1mol/L的Rhodamine對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，于37 ℃環(huán)境下放置30min，使得細(xì)胞染色均勻，而后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)（進(jìn)行細(xì)胞熒光強(qiáng)度檢測(cè)）。

1.4.4鈣離子濃度檢測(cè)：以PBS對(duì)胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行洗滌，通常洗滌2次，后收集細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)加入5μmol/L的Flou-3-AM，并在37 ℃恒溫條件下進(jìn)行負(fù)載至Flou-3進(jìn)入至細(xì)胞內(nèi)部。對(duì)于未負(fù)載成功的熒光探測(cè)劑進(jìn)行洗滌，并通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié) 果

2.1DNA含量檢測(cè)結(jié)果：細(xì)胞發(fā)生凋零時(shí)，可激活核酸內(nèi)切酶，致死DNA出現(xiàn)斷裂。以PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，可顯示出“亞二倍峰”，及所謂的凋零峰。通過(guò)凋零峰，可對(duì)細(xì)胞凋零的百分率進(jìn)行計(jì)算。在此次試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組應(yīng)存在LPS刺激的差異，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組DNA斷裂的發(fā)生率明顯高于對(duì)照組。因此，可通過(guò)DNA含量檢測(cè)來(lái)確定細(xì)胞凋零率。

2.2磷脂結(jié)合蛋白AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果：在細(xì)胞凋零早期，細(xì)胞膜可發(fā)生重排反應(yīng)。重排反應(yīng)可使得磷酯酰絲氨酸由細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜表面。AnnexinV可與翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞外部的磷酯酰絲氨酸相結(jié)合，反應(yīng)細(xì)胞早期凋零時(shí)的情況。而PI中晚期凋零細(xì)胞及死亡細(xì)胞進(jìn)行染色反應(yīng)，PI作為核酸染料，可直接穿透細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，使其細(xì)胞核呈紅色。因此，可通過(guò)AnnexinV-FITC/PI區(qū)分細(xì)胞的早、中、晚及死亡期。

2.3線粒體膜電位檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果：當(dāng)膜電位下降時(shí)，可表示細(xì)胞處于凋零早期。當(dāng)線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1以單體形式存在。經(jīng)檢測(cè)，此時(shí)其所激發(fā)的波長(zhǎng)為488 nm、發(fā)射的波長(zhǎng)為529 nm，所呈現(xiàn)出的為綠色熒光。當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1以聚合體形式存在。經(jīng)檢測(cè)，此時(shí)其所激發(fā)的波長(zhǎng)為490 nm、發(fā)射的波長(zhǎng)為590 nm，所呈現(xiàn)出的紅橙色熒光。因此，可通過(guò)線粒體膜電位的檢測(cè)結(jié)果反映出細(xì)胞凋零早期。此次試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞熒光顯示逐漸由紅橙色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色。

而羅丹明123染料是一種線粒體跨膜電位指示劑，其可直接透過(guò)細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞正常時(shí)，羅丹明123染劑可通過(guò)線粒體跨膜電位直接進(jìn)入線粒體機(jī)制，使得熒光強(qiáng)度明顯減弱或消失。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋零時(shí)，線粒體膜可受到破壞，并可重新釋放出線粒體，熒光強(qiáng)度增加，并主要放射出黃綠色熒光。可見(jiàn)，羅丹明123染料檢測(cè)也可直接反映出細(xì)胞凋零的情況。此次實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞黃綠色熒光強(qiáng)度明顯增加。

2.4鈣離子濃度檢測(cè)結(jié)果：Flou-3-AM不能與游離于細(xì)胞外的Ca2+相結(jié)合，但其進(jìn)入細(xì)胞后，其可脫去“-AM”。形成脂溶性的Flou-3，F(xiàn)lou-3可與細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子相結(jié)合，并可釋放出高于本身40倍左右的熒光強(qiáng)度。因此，通過(guò)Flou-3-AM檢測(cè)，可有效區(qū)分細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子含量。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋零時(shí)，細(xì)胞外的Ca2+會(huì)出現(xiàn)內(nèi)流情況，使得細(xì)胞內(nèi)的Ca2+含量明顯的增多。此次實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞的黃綠色熒光強(qiáng)度明顯增加。

3　討 論

對(duì)于細(xì)胞凋零檢測(cè)，每種檢測(cè)方法均存在一定的局限性，如DNA含量檢測(cè)法，僅可反應(yīng)細(xì)胞的凋零率，而并不能反應(yīng)出細(xì)胞的凋零階段，其檢測(cè)特異性欠佳［2］。因此，在進(jìn)行細(xì)胞凋零檢測(cè)時(shí)，需進(jìn)行針對(duì)性的方法選擇，提高檢測(cè)效率。筆者對(duì)每種檢測(cè)方法的缺點(diǎn)進(jìn)行一定的總結(jié)，具體如下［3-4］：①DNA含量檢測(cè)。DNA含量檢測(cè)特異性較低，除了凋零細(xì)胞外，機(jī)械損傷性細(xì)胞或本身細(xì)胞內(nèi)DNA含量就較低的細(xì)胞均可出現(xiàn)凋零峰，因此，單獨(dú)的DNA含量檢測(cè)并不能確定細(xì)胞為凋零細(xì)胞。②Annexin-V-FITC/PI檢測(cè)法。該種檢測(cè)方法可對(duì)細(xì)胞凋零的分期階段進(jìn)行顯示，但卻無(wú)法分辨出凋零或壞死的細(xì)胞，由于壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性也明顯的增強(qiáng)，因此，在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需控制凋零細(xì)胞及壞死細(xì)胞的比例。③線粒體膜電位檢測(cè)。細(xì)胞凋零與膜電位下降呈正相關(guān)關(guān)系，這是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的過(guò)程。④鈣離子濃度測(cè)定。鈣離子內(nèi)流的情況不僅僅在于發(fā)生細(xì)胞凋零，其檢測(cè)結(jié)果易受到外界環(huán)境因素的影響。

總之，結(jié)合多種方法進(jìn)行細(xì)胞凋零檢測(cè)，可明顯提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。同時(shí)，在進(jìn)行檢測(cè)前對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行針對(duì)性的選擇，可有效提高檢測(cè)效率。

［1］ 顧芳，秦宜德，羅欣，等.細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)信息，2014，32（10）：517-518.

［2］ 孫建平，譚竹鈞，韓雅莉，等.細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2012，（1）：54-59.

［3］ 高楓.細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法及其研究進(jìn)展［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2013，42（8）：1082-1083.

［4］ Yu S，Deng G，Qian D，et al Detection of apoptosis-associated microRNA in human apheresis platelets during storage by quantitative real-time polymerase chain reaction analysis［J］. Blood Transfus，2014，12（4）：541-547.

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1671-8194（2015）10-0077-02