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    紫外法測(cè)定重組人紅細(xì)胞生成素(Fc)融合蛋白的含量

    2015-10-22 06:26:58張桂濤李慶昌韓為躍
    中國(guó)醫(yī)藥指南 2015年10期
    關(guān)鍵詞:糖基化法測(cè)定氯化鈉

    張桂濤 陽 勇 李慶昌 何 凱 韓為躍

    (廣東聯(lián)康生物與醫(yī)藥研究院,廣東 東莞 523581)

    紫外法測(cè)定重組人紅細(xì)胞生成素(Fc)融合蛋白的含量

    張桂濤陽勇李慶昌何凱韓為躍

    (廣東聯(lián)康生物與醫(yī)藥研究院,廣東 東莞 523581)

    目的 建立紫外法測(cè)定重組人紅細(xì)胞生成素(Fc)融合蛋白(rhEPO-Fc)含量的方法。方法 利用Edelhoch法測(cè)定rhEPO-Fc的摩爾消光系數(shù),計(jì)算得到其溶液百分比消光系數(shù),并測(cè)定rhEPO-Fc溶液A280值,依據(jù)公式c=A/ε計(jì)算rhEPO-Fc的含量。結(jié)果 rhEPO-Fc溶液百分比消光系數(shù)為1.3,在0.02~1.28 mg/mL濃度范圍內(nèi),測(cè)定含量結(jié)果偏差<4%。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可用于rhEPO-Fc含量測(cè)定。

    消光系數(shù);紅細(xì)胞生成素;融合蛋白

    蛋白質(zhì)定量是重組蛋白藥物研究開發(fā)中最基本的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,常用的定量方法包括Bradford、Lowry和HPLC法等,這些方法需要對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品,而重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品一般情況下無法獲取,以前多采用牛血清白蛋白或者人血清白蛋白作為替代標(biāo)準(zhǔn)品用于重組蛋白的含量測(cè)定,但不同蛋白質(zhì)的氨基酸組成不同,其理化性質(zhì)不同,因此用非同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定蛋白含量偏差比較大,不能準(zhǔn)確反映待測(cè)蛋白的真實(shí)含量。近年來,紫外吸光法已成為FDA、EMA推薦的重組蛋白藥物含量測(cè)定方法之一。在摩爾消光系數(shù)及相對(duì)分子質(zhì)量已知的情況下,僅需要測(cè)定樣品的光吸收值,即可計(jì)算出蛋白濃度,而不需要蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。

    目前已知的摩爾消光系數(shù)的測(cè)定有幾種方法,包括dry weight[1]、nitrogen determination[2]和spectral method[3],這幾種方法都存在蛋白質(zhì)用量大、過程繁瑣等缺點(diǎn),限制了它們?cè)趯?shí)驗(yàn)室的使用。

    rhEPO-Fc為創(chuàng)新蛋白質(zhì)藥物,擬用于腎性貧血治療,該藥物制劑在臨床預(yù)試驗(yàn)中表現(xiàn)出長(zhǎng)效化特征,該蛋白利用EPO融合Fc片段后以同源二聚體形式存在,理論上其半胱氨酸都以二硫鍵形成胱氨酸,因此其變性狀態(tài)下的摩爾消光系數(shù)為111280;而二聚體的氨基酸相對(duì)分子質(zhì)量為88629.2。

    本研究中,筆者采用Edelhoch法測(cè)定rhEPO-Fc的摩爾消光系數(shù),計(jì)算得到其溶液百分比消光系數(shù),從而依據(jù)公式(1)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量;本法具有的優(yōu)點(diǎn):在確定溶液百分比消光系數(shù)后,不需要任何反應(yīng),可直接測(cè)定該蛋白溶液的吸收值,從而計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量,操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性良好且專屬性強(qiáng)。

    1 材料與儀器

    rhEPO-Fc原液(純度>95%,自制),脫鹽柱為Amersham Biosciences產(chǎn)品(貨號(hào):52-13080-00)。紫外分光光度計(jì)(Beckman DU730)。鹽酸胍、氯化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1rhEPO-Fc消光系數(shù)的測(cè)定:將經(jīng)脫鹽得到的rhEPO-Fc水溶液用超純水稀釋3、6、12、24、48倍,分別測(cè)定A280。由于在蛋白溶液中蛋白顆粒會(huì)出現(xiàn)光散射現(xiàn)象,因此必須對(duì)A280進(jìn)行校正,即扣除光散射值A(chǔ)光散射。A光散射的測(cè)定方法是測(cè)定溶液在320、325、330、335、340、345、350 nm波長(zhǎng)處的吸光度,用線性回歸法,以吸光度的對(duì)數(shù)值與其相對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的對(duì)數(shù)值繪圖,獲得最適標(biāo)準(zhǔn)曲線,將此標(biāo)準(zhǔn)曲線外推至280 nm波長(zhǎng),從而確定A280光散射。同樣,將EPO-Fc蛋白水溶液用相同的稀釋倍數(shù)溶解在6mol/L鹽酸胍溶液中,分別測(cè)定其A280和A280光散射。計(jì)算同一濃度的rhEPO-Fc在水溶液和6mol/L鹽酸胍溶液中紫外吸收值的比值,并利用公式(3)(4)(5)計(jì)算rhEPO-Fc水溶液中的溶液百分比消光系數(shù)。結(jié)果:rhEPO-Fc的消光系數(shù)為1.3,RSD=0.41%,見表1。

    表1 溶液百分比消光系數(shù)測(cè)定結(jié)果

    2.2溶液百分比消光系數(shù)測(cè)定干擾性試驗(yàn)

    2.2.1糖基化對(duì)rhEPO-Fc溶液百分比消光系數(shù)的影響:對(duì)于糖蛋白,雖然單糖分子在280 nm處沒有紫外吸收值,但是其糖鏈組成可能會(huì)影響到蛋白質(zhì)的構(gòu)象,從而影響糖蛋白的紫外吸收值。為了研究糖基化是否對(duì)rhEPO-Fc的消光系數(shù)存在影響,取rhEPO-Fc蛋白原液,用肽N-糖苷酶F酶切N-糖鏈,酶切完成后,蛋白質(zhì)用Protein A柱進(jìn)行純化,去除肽N-糖苷酶F和反應(yīng)緩沖液,用上述方法測(cè)定無糖基化的rhEPO-Fc的溶液百分比消光系數(shù),結(jié)果為1.2,去除糖基后的rhEPO-Fc消光系數(shù)下降了約7%,這說明糖基化會(huì)影響糖蛋白的消光系數(shù),但是并不顯著,可能是由于蛋白糖基化后構(gòu)象發(fā)生改變引起。

    2.2.2離子強(qiáng)度對(duì)rhEPO-Fc溶液百分比消光系數(shù)的影響:取適量的rhEPO-Fc蛋白水溶液,調(diào)整A280在0.6~1.4,用不同濃度的氯化鈉分別進(jìn)行倍比稀釋,使rhEPO-Fc蛋白溶液中氯化鈉的濃度分別為0、0.25、0.5、1.00、1.50、2.00mol/L,混合靜置2~3min后用分光光度計(jì)分別測(cè)定其A280和A280光散射,校正A280,結(jié)果見表2,rhEPO-Fc蛋白在0.25~2.00mol/L的氯化鈉溶液中A280值變化不大,而且與在0mol/L氯化鈉溶液中相當(dāng),說明2mol/L以下的氯化鈉不影響蛋白質(zhì)的光吸收值,即不影響其溶液百分比消光系數(shù)。見表2。

    表2 rhEPO-Fc在不同濃度氯化鈉中的吸光值

    2.3濃度測(cè)定范圍確定:取適量rhEPO-Fc蛋白原液,用超純水稀釋成濃度為1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01 mg/mL,分別測(cè)定其A280和A280光散射。同時(shí),利用rhEPO-Fc溶液百分比消光系數(shù)計(jì)算理論吸收值,并比較由計(jì)算得到的吸收值相對(duì)于測(cè)定校正吸收值的偏差,結(jié)果見表3,rhEPO-Fc濃度在0.02~1.28 mg/mL范圍檢測(cè)紫外吸收值與計(jì)算吸收值的相對(duì)偏差<4%,因此,在該濃度范圍內(nèi),紫外法測(cè)定該rhEPO-Fc含量是可信的。見表3。

    2.4重復(fù)性試驗(yàn):分別取同批rhEPO-Fc原液5份,分別測(cè)定A280和A280光散射,校正A280,利用公式(1)計(jì)算得到原液含量為0.97 mg/mL,RSD=0.65%(n=5),重復(fù)性良好。

    表3 相同濃度rhEPO-Fc測(cè)定校正后A280與c=A/εAbs0.1%計(jì)算A280比較

    3 討 論

    利用Edelhoch法測(cè)定rhEPO-Fc蛋白的摩爾消光系數(shù),操作簡(jiǎn)便,可用于rhEPO-Fc含量的測(cè)定。但考慮到消光系數(shù)的專屬性,為保證結(jié)果的準(zhǔn)確,待檢樣品的純度應(yīng)不低于95%,即所含的目標(biāo)蛋白幾乎為rhEPO-Fc的情況下,計(jì)算的rhEPO-Fc原液含量才更準(zhǔn)確。筆者研究了數(shù)十種蛋白質(zhì)消光系數(shù)發(fā)現(xiàn),利用Edelhoch法測(cè)定的摩爾消光系數(shù)和直接經(jīng)公式ε=(Trp數(shù)量)×5500+(Tyr數(shù)量)×1490+(cystine數(shù)量)×125計(jì)算的摩爾消光系數(shù)比較,大部分蛋白的偏差都5%左右,少數(shù)蛋白的偏差超過10%,如Rituximab。重組糖蛋白的糖基化程度、糖基化位點(diǎn)及糖基化的類型對(duì)其消光系數(shù)的影響也不盡相同,如rhEPO-Fc脫糖后的消光系數(shù),相對(duì)于脫糖前下降約7%左右,而Rituximab脫糖前后幾乎無差異。該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高,可用于純度高rhEPO-Fc原液或制劑的定量。

    [1] Hunter MJ.A method for the determination of protein partial secific volum[J].J Phys Chem,1996,70(10):3285-3292.

    [2] Jaenicke L.A rapid micromethod for the determination of nitrogen and phosphate in biological material[J].Anal Biochemis ty,1974,61(4):623-627.

    [3] Whitaker JR, Granum PE.An absolute method for protein determination based on difference in absorbance at 235 and 280 nm[J] .Anal Biochem,1980,109(1):156-159.

    R-3

    B

    1671-8194(2015)10-0065-02

    廣東省重大科技專項(xiàng)(重大新藥創(chuàng)制)課題(編號(hào):2011A080502001)

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