氧化石墨烯與核酸適配體在檢測(cè)方面應(yīng)用的進(jìn)展

林彥鋒，劉宇洋，高順祥，王梁華，胡波Δ

(1.第二軍醫(yī)大學(xué) 學(xué)員旅，上海 200433；2．第二軍醫(yī)大學(xué) 海洋生物醫(yī)藥研究中心 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433)

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氧化石墨烯與核酸適配體在檢測(cè)方面應(yīng)用的進(jìn)展

林彥鋒1，劉宇洋1，高順祥2，王梁華2，胡波2Δ

(1.第二軍醫(yī)大學(xué) 學(xué)員旅，上海 200433；2．第二軍醫(yī)大學(xué) 海洋生物醫(yī)藥研究中心 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433)

核酸適配體是一類能與靶物質(zhì)高親和力和特異性結(jié)合的寡核苷酸鏈，氧化石墨烯是一種具有多種獨(dú)特理化性質(zhì)的新興材料，近年來(lái)它逐漸應(yīng)用到了核酸適配體領(lǐng)域并取得了一系列進(jìn)展。本文綜述了近年來(lái)氧化石墨烯與核酸適配體針對(duì)小分子及金屬離子、生物大分子和細(xì)胞等不同靶物質(zhì)的檢測(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)展，以期為氧化石墨烯在適配體檢測(cè)領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用提供參考。

適配體；氧化石墨烯；檢測(cè)；指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)；適配體傳感器

適配體(aptamer)是一類能與靶物質(zhì)高親和力和特異性結(jié)合的隨機(jī)寡核苷酸鏈，它通過(guò)SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化)技術(shù)從大容量的隨機(jī)文庫(kù)中篩選得到，自從1990年適配體第一次被提出后，已得到了快速發(fā)展并應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、診斷、治療等多個(gè)領(lǐng)域[1-2]。適配體的特性包括適用靶物質(zhì)范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)、免疫原性低、易于修飾且不丟失活性、生產(chǎn)容易、價(jià)格低廉等。因此，適配體與抗體相比具有諸多優(yōu)勢(shì)，很有可能在不久的將來(lái)成為抗體的替代物。

石墨烯(graphene)最早于2004年由Novoselov等[3]報(bào)道，之后因其獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注，包括雙倍的外表面積，良好的化學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度、導(dǎo)熱性、導(dǎo)電性以及光透性等。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯的氧化形式，它不僅保留了石墨烯的層狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)因?yàn)檠趸倌軋F(tuán)的引入而獲得了與石墨烯不同的性質(zhì)，呈現(xiàn)出聚合物、膠體、薄膜以及兩性分子等諸多特性。不同于石墨烯，GO具有水溶性并且易于大規(guī)模合成；另一個(gè)特性是它的π-π鍵分子吸附作用，表現(xiàn)出對(duì)適配體的高親和力。在適配體應(yīng)用方面，GO可以作為一種優(yōu)秀的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)的接收器?；谏鲜鰞?yōu)良性質(zhì)，使得GO成為適配體領(lǐng)域研究的熱門材料[4-5]。

1 氧化石墨烯與適配體在檢測(cè)方面的應(yīng)用

GO在適配體檢測(cè)中的應(yīng)用包括多種方式。傳統(tǒng)方法是直接通過(guò)物理或化學(xué)的方式將GO與適配體結(jié)合。GO可以通過(guò)物理吸附作用將適配體固定在其表面，從而提供一個(gè)檢測(cè)的平臺(tái)。當(dāng)適配體與靶物質(zhì)特異結(jié)合時(shí)，適配體從GO表面解離，進(jìn)而通過(guò)檢測(cè)這一變化來(lái)對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。也有研究報(bào)道了通過(guò)共價(jià)鍵將GO與適配體結(jié)合的方法[6]，這一方法較之物理吸附，能更好地抵抗蛋白的非特異性吸附。而目前較前沿的方法是將GO與適配體以及其他材料結(jié)合形成復(fù)合物，包括適配體-納米金-雜交氧化石墨烯復(fù)合物(Apt-AuNPs-GO)[7]、氯高鐵血紅素功能化的還原氧化石墨烯復(fù)合物(hemin-rGO)[8]、中空二氧化鈦納米球-三維還原氧化石墨烯-聚吡咯(TiO2/3D-rGO/PPy)納米復(fù)合物[9]等。通過(guò)不同材料間的相互組合，使得適配體復(fù)合物具有不同的理化性質(zhì)，從而達(dá)到更好的檢測(cè)效果。

目前基于GO的適配體檢測(cè)方法主要包括以下幾種：熒光檢測(cè)法[10-14]、電化學(xué)法[15-17]、比色法[8]等。熒光檢測(cè)法是將適配體進(jìn)行熒光基團(tuán)修飾，在適配體與靶物質(zhì)結(jié)合后，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度來(lái)反映靶物質(zhì)的含量；或者利用GO的熒光淬滅效應(yīng)，當(dāng)適配體與靶物質(zhì)結(jié)合時(shí)，適配體與GO解離，熒光恢復(fù)，通過(guò)熒光信號(hào)的變化來(lái)對(duì)靶物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。電化學(xué)法是通過(guò)適配體將靶物質(zhì)捕捉到電極界面，從而形成一種障礙阻礙電子轉(zhuǎn)移，通過(guò)檢測(cè)這一電信號(hào)的變化來(lái)間接檢測(cè)靶物質(zhì)的含量。比色法則是通過(guò)某種化學(xué)反應(yīng)使溶液呈現(xiàn)一定顏色，而當(dāng)適配體與靶物質(zhì)結(jié)合時(shí)阻礙了這一反應(yīng)的進(jìn)行，使溶液呈現(xiàn)與之前不同的顏色，通過(guò)檢測(cè)溶液色差變化進(jìn)行靶物質(zhì)的檢測(cè)。

基于適配體適用靶物質(zhì)范圍廣的特點(diǎn)，目前GO在適配體檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用主要包括以下3個(gè)方面：

1.1 小分子及金屬離子檢測(cè) 對(duì)氯霉素的檢測(cè)與定量能夠減少食品安全的風(fēng)險(xiǎn)，Alibolandi等[18]報(bào)道了一種基于QDs-Apt的“turn-on”適配體與GO的復(fù)合物用于氯霉素的檢測(cè)，基于適配體與氯霉素的特異結(jié)合讓能量在QDs-Apt與GO間轉(zhuǎn)移的原理，使得熒光相應(yīng)淬滅與恢復(fù)，從而檢測(cè)氯霉素的含量。該適配體傳感器具有98 pM的最低檢出限和987 pM的最低定量限，同時(shí)對(duì)氯霉素表現(xiàn)出極高的選擇性，而且對(duì)實(shí)際牛奶樣品中的氯霉素也能達(dá)到0.2 ppb的檢測(cè)極限。

啶蟲(chóng)脒是一種常用的殺蟲(chóng)劑。Yang等[8]報(bào)道了一種氯高鐵血紅素功能化的還原氧化石墨烯(hemin-rGO)適配體傳感器用于啶蟲(chóng)脒的比色法檢測(cè)。hemin-rGO復(fù)合物兼具rGO的物理吸附適配體的能力和氯高鐵血紅素的過(guò)氧化物酶樣活性，可以在H202中催化TMB，從而使溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)溶液中的啶蟲(chóng)脒的量越多時(shí)，吸附于hemin-rGO表面的自由適配體越少，離心后的上清液呈現(xiàn)出低吸光度的淡藍(lán)色。這種與啶蟲(chóng)脒濃度相關(guān)的色差能被裸眼識(shí)別，也能被紫外分光儀檢測(cè)。這種方法對(duì)啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)范圍為100nM～10 μM，最低檢出限為40 nM (S/n=3)，而且具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前對(duì)生物體內(nèi)與生態(tài)環(huán)境中的鉛離子進(jìn)行檢測(cè)依然是一個(gè)挑戰(zhàn)。Qian等[19]制備了一種熒光開(kāi)啟的檢測(cè)鉛離子的納米傳感器。這種適配體傳感器能高特異性可重復(fù)地從其他離子中檢測(cè)出Pb2+離子，并且這種檢測(cè)方法僅需1 min左右的反應(yīng)時(shí)間，最低檢出限可達(dá)0.6 nM。

雙酚A(BPA)是一種環(huán)境激素。Zhu等[20]報(bào)道了一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)檢測(cè)雙酚A的方法。在不同的BPA濃度下，BPA引起適配體構(gòu)象的改變，進(jìn)而改變熒光修飾的適配體與GO的相互作用，導(dǎo)致熒光信號(hào)的改變。該方法的檢測(cè)范圍為0.1～10 ng/mL，最低檢出限為0.05 ng/mL。另外，這一方法對(duì)BPA類似物無(wú)交叉反應(yīng)，在實(shí)際樣品中的重復(fù)率為96.0%～104.5%。

1.2 生物大分子檢測(cè) Xu等[21]發(fā)展了一種非標(biāo)記的三螺旋結(jié)構(gòu)適配體(THA)作為檢測(cè)平臺(tái)，起到“信號(hào)開(kāi)關(guān)”的作用，用于凝血酶的熒光檢測(cè)。此方法利用了THA作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器和GO作為熒光猝滅器，在保證對(duì)凝血酶的高特異性與敏感性的同時(shí)，檢測(cè)范圍為5～1200 nM，最低檢出限為1.8 nM(S/n=3)?？紤]到THA的同源多樣性，這種適配體傳感器可以作為一種用于THA同源性物質(zhì)的熒光檢測(cè)平臺(tái)。

Wang等[9]報(bào)道了一種基于中空二氧化鈦納米球-三維還原氧化石墨烯-聚吡咯(TiO2/3D-rGO/PPy)納米復(fù)合物的適配體傳感器用于溶菌酶的檢測(cè)。通過(guò)電化學(xué)微分脈沖伏安法，得出該傳感器對(duì)溶菌酶的最低檢出限為0.085 ng/mL(5.5 pM)，檢測(cè)范圍為0.1～50 ng/mL(0.007～3.5 nM)。這種適配體傳感器同樣表現(xiàn)出對(duì)溶菌酶的高特異性，不受其他共存蛋白的干擾。這種傳感器提供了一種快速、高選擇性、高敏感性檢測(cè)溶菌酶的方法，同時(shí)也表明TiO2/3D-rGO/PPy納米復(fù)合物能夠作為一種生物醫(yī)藥領(lǐng)域的檢測(cè)蛋白的電化學(xué)生物傳感器。

Zhou等[22]提出了一種新的檢測(cè)癌胚抗原的方法，基于適配體-GO并通過(guò)毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。熒光強(qiáng)度與CEA濃度在0.0654～6.54 ng/mL之間存在線性關(guān)系，最低檢出限為4.8pg/mL(S/n=3)。

1.3 微生物和細(xì)胞檢測(cè) 目前，氧化石墨烯與適配體應(yīng)用于細(xì)胞水平的檢測(cè)主要集中于病原微生物和腫瘤細(xì)胞2個(gè)領(lǐng)域。

病原微生物方面，目前已報(bào)道了針對(duì)沙門氏菌[23]和金黃色葡萄球菌[24]的檢測(cè)方法。前者采用了以GO和納米金顆粒為主要介質(zhì)的電化學(xué)傳感器，通過(guò)檢測(cè)電化學(xué)阻抗光譜來(lái)對(duì)沙門氏菌定量，其最低檢出限為3 cfu/mL；后者以石墨烯為轉(zhuǎn)導(dǎo)層，適配體為感應(yīng)層，并用氧化石墨烯作為整個(gè)傳感器的空間構(gòu)架，所制成的電勢(shì)適配體傳感器不僅最低檢出限可達(dá)1 cfu/mL，同時(shí)能夠保證高選擇性。這2種檢測(cè)方法與傳統(tǒng)方法相比具有低檢測(cè)限和快速檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，有望成為病原微生物檢測(cè)的新方法。

血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)由于其表達(dá)多種標(biāo)志物，一種CTC標(biāo)志物不足以捕獲血液中所有的CTC，因此高特異性敏感性地捕獲和識(shí)別CTC目前依然存在諸多挑戰(zhàn)。對(duì)此，Viraka Nellore等[25]報(bào)道了一種從血液中高效捕獲和精確識(shí)別多種類型的CTC的方法，使用了一種適配體修飾的多孔滲水的GO膜。該方法將熒光修飾的S6、A9和YJ-1適配體吸附于20～40 μm多孔GO膜上，并且成功從患者血液中同時(shí)且高選擇性地捕獲到了多種腫瘤細(xì)胞(SKBR3乳腺癌細(xì)胞，LNCaP前列腺癌細(xì)胞，SW-948結(jié)腸癌細(xì)胞)。對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞，捕獲效率約為95%；對(duì)于一種腫瘤細(xì)胞，最低檢出限為每毫升10個(gè)細(xì)胞。這一細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)對(duì)于一些目前依賴于細(xì)胞捕獲技術(shù)進(jìn)行早期診斷的疾病來(lái)說(shuō)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2 展望

基于氧化石墨烯各種獨(dú)特的理化性質(zhì)，它作為一種新材料在適配體的研究方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。然而，氧化石墨烯的應(yīng)用依然有很多問(wèn)題尚待解決。如何避免檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性，并進(jìn)一步提高適配體復(fù)合物的特異性與敏感性？如何降低現(xiàn)有的檢測(cè)手段的成本問(wèn)題？如何發(fā)展更為高效、價(jià)廉、便捷的檢測(cè)方法？另外，如果要將適配體復(fù)合物應(yīng)用于人體，它是否具有潛在的不良反應(yīng)？如何解決上述問(wèn)題將成為氧化石墨烯在適配體檢測(cè)方面未來(lái)的研究方向。

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(編校：王儼儼)

Application progress of graphene oxide and aptamer in detection

LIN Yan-feng1, LIU Yu-yang1, GAO Shun-xiang2, WANG Liang-hua2, HU Bo2Δ

(1.Cadet Brigade, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China; 2.Marine Bio-pharmaceutical Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

Aptamers are oligonucleotides which can combine targets with high affinity and specificity.Graphene oxide is a kind of new material with many unique physical and chemical properties.Recently, graphene oxide is gradually applied to the field of aptamers and has made a series of progress.This review focused on the application progress of graphene oxide and aptamers in the detection of different targets including small molecules and metal ion, biomacromolecules and cells in order to provide references for the mass application of graphene oxide and aptamers in the field of detection.

aptamer; graphene oxide; detection; systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX); aptasensor

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2013AA092900)

林彥鋒，男，本科，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：601263186@qq.com；胡波，通訊作者，男，碩士，講師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：hb8601@163.com。

Q503

A

1005-1678(2015)08-0186-03