產(chǎn)β-葡聚糖酶黑曲霉固態(tài)孢子增殖工藝研究

■張建華 黃 娟 李 昆 于 淼 侯 莉 王德培

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

黑曲霉在生長過程中會產(chǎn)生各種水解酶,其中農(nóng)業(yè)部允許使用的酶制劑目錄中，11種可由該菌生產(chǎn)，分別是淀粉酶、α-半乳糖苷酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果膠酶、植酸酶、蛋白酶、木聚糖酶。β-葡聚糖酶是纖維素酶酶系的重要組成部分，該酶最先用于啤酒工業(yè)分解大麥中β-1,3和β-1,4糖苷鍵，可降低麥汁黏度，提高麥汁的過濾速度和出汁率，改善啤酒質(zhì)量。在大麥等谷物及糠麩飼料中添加β-葡聚糖酶可消除β-葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用,使其失去親水性和黏性、改變單胃動物腸道內(nèi)容物的黏度及消化酶的活性,提高飼料利用率、畜禽的生長性能及整齊度，對于改善飼料的營養(yǎng)價值,提高禽畜的生產(chǎn)性能具有重要意義。國內(nèi)目前對發(fā)酵生產(chǎn)β-葡聚糖酶的研究，主要是以芽孢桿菌或黑曲霉為材料。黑曲霉在液體培養(yǎng)中是不產(chǎn)孢的，只有在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢。在工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域中，菌株的擴大培養(yǎng)是發(fā)酵工藝的重要環(huán)節(jié)，目前孢子擴培主要應(yīng)用麩皮固態(tài)培養(yǎng)，機械化程度最低，勞動密集度高，而且培養(yǎng)時間長，生產(chǎn)效率低。為了提高黑曲酶產(chǎn)孢量，本文采用人工合成固態(tài)培養(yǎng)法生產(chǎn)黑曲霉孢子,此方法孢子生長速度快，產(chǎn)孢量大，可實現(xiàn)機械化生產(chǎn)等優(yōu)點。本文對黑曲霉（Aspergillus niger）TCCC 41649菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶的最適產(chǎn)孢培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（A.niger）TCCC 41649，由天津科技大學(xué)微生物保藏中心保藏。

1.2 試劑

葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、NH4Cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、草酸銨、檸檬酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、Zn?SO4·7H2O、MnCl2均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 斜面培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：稱取已去皮的馬鈴薯200 g，加水500 ml加熱煮沸30 min，四成紗布過濾，加入葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g溶液定容至1 000 ml，pH值自然，趁熱分裝于500 ml三角瓶，每瓶50 ml左右，121℃、滅菌20 min后取出，擱置成斜面，冷卻至室溫備用。

1.3.2 基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基

基礎(chǔ)產(chǎn)孢培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1.5 g/l、硫酸銨5 g/l、麥芽糖 15 g/l、硫酸鎂0.5 g/l、硫酸鋅0.01 g/l、氯化錳0.06 g/l、瓊脂粉20 g/l，pH值自然，121 ℃、20 min滅菌。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養(yǎng)方法

500 ml的三角瓶中加入150 ml的固體培養(yǎng)基，以接種量為103個孢子接入三角瓶中，35℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)96 h后洗出孢子涂平板計數(shù)。

1.4.2 孢子懸液的制備

用加有0.1%吐溫80及玻璃珠的100 ml無菌水將三角瓶中培養(yǎng)96 h的黑曲霉孢子洗出，再經(jīng)過適當(dāng)稀釋后進(jìn)行涂布。

1.4.3 孢子計數(shù)

通過平板單菌落計數(shù)，計算得出三角瓶中103個孢子的最終產(chǎn)孢總數(shù)。

1.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.5.1 接種量的選擇

選擇基礎(chǔ)固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基，培養(yǎng)基體積為150 ml，設(shè)定不同接種量102～105個孢子，接種于三角瓶中進(jìn)行孢子增殖培養(yǎng)。比較不同接種量對孢子增殖的影響，確定最適接種量。

1.5.2 培養(yǎng)基體積的選擇

選擇基礎(chǔ)固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基，分別在三角瓶中加入100～300 ml的培養(yǎng)基，以最適的接種量接種孢子，比較不同培養(yǎng)基體積對孢子增殖的影響，確定最適培養(yǎng)基體積。

1.6 固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.6.1 碳源的優(yōu)化

選擇30.0 g/l的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖作為碳源，在已優(yōu)化的最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，比較不同碳源對孢子增殖的影響，確定最適碳源。加入30.0～65.0 g/l的最適碳源，確定最適碳源的最優(yōu)質(zhì)量濃度。

1.6.2 氮源的優(yōu)化

以最適質(zhì)量濃度的碳源為培養(yǎng)基基本組分，無機氮源添加量以氮元素摩爾數(shù)相等為依據(jù)，總氮元素含量為1.0 g/l條件下，加入不同種類無機氮源，比較其對產(chǎn)孢的影響，確定最適無機氮源。加入含氮量分別為1.0～5.0 g/l最適無機氮源，確定最適無機氮源的最優(yōu)質(zhì)量濃度。

1.6.3 KH2PO4對孢子增殖的影響

以最優(yōu)質(zhì)量濃度的碳源、氮源為培養(yǎng)基的基本組分，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入濃度分別為0.2～2.5 g/l KH2PO4，在最適的培養(yǎng)條件下進(jìn)行孢子增殖培養(yǎng)，確定最優(yōu)的KH2PO4濃度。

1.6.4 MgSO4對孢子增殖的影響

以最優(yōu)質(zhì)量濃度的碳源、氮源、KH2PO4為培養(yǎng)基的基本組分，加入濃度分別為0.1～2.5 g/l MgSO4，在最優(yōu)的培養(yǎng)條件下進(jìn)行孢子增殖培養(yǎng)，確定最優(yōu)的MgSO4濃度。1.6.5 正交試驗

利用 L9(34)正交試驗篩選出KH2PO4、MgSO4、ZnSO4和MnCl2的最佳配比。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.1.1 接種量對孢子增殖的影響(見圖1)

圖1 接種量對孢子增殖的影響

在一定空間內(nèi)接種量小，氧供給充足，會導(dǎo)致菌體代謝旺盛而產(chǎn)孢率低。相反接種量過大會導(dǎo)致氧氣不充足，使菌體生長緩慢且形成無氧代謝產(chǎn)物，不利于孢子增殖。

500 ml三角瓶相同培養(yǎng)基條件接入不同孢子量對孢子最后增殖影響較大，如圖1所示，當(dāng)接種量為103個孢子時，單孢產(chǎn)孢量最高達(dá)4.67×106個，隨著接種量增加，產(chǎn)孢量卻隨之下降。研究可知，由于菌體相對密度增大，導(dǎo)致生長時所需培養(yǎng)基內(nèi)溶氧不足，菌體生長狀態(tài)不良，從而使產(chǎn)孢量降低，所以本試驗選取103個孢子為最適接種量。

2.1.2 培養(yǎng)基體積對孢子增殖的影響（見圖2）

圖2 培養(yǎng)基體積對孢子增殖的影響

溶解氧的大小對菌體生長、產(chǎn)物的形成及產(chǎn)孢量都會產(chǎn)生不同的影響，由于氧在固體中溶解度很小，黑曲霉生長過程中，基內(nèi)菌絲的氧獲得都來自于固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧的多少與固體培養(yǎng)基體積成正比，同樣在500 ml三角瓶相同接種量下，不同體積培養(yǎng)基孢子增殖影響顯著。

由圖2結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基體積為150 ml時，單孢產(chǎn)孢量最大為4.57×106個孢子。當(dāng)培養(yǎng)基體積為100 ml時，由于溶氧不足，菌體生長緩慢導(dǎo)致產(chǎn)孢量不高。培養(yǎng)基體積在150 ml以上時，隨著培養(yǎng)基體積的增加，產(chǎn)孢量下降。所以本試驗選取150 ml為最適培養(yǎng)基體積。

2.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 碳源的篩選（見圖3～圖4）

黑曲霉產(chǎn)孢通常以麩皮作為培養(yǎng)基，由于麩皮其本身成分波動較大，孢子生長緩慢需要7 d，嚴(yán)重影響孢子生長速度和增殖數(shù)量，而且不利于自動化操作，因此試驗選取不同碳源進(jìn)行黑曲霉產(chǎn)孢。

由圖3可知，四種碳源對黑曲霉產(chǎn)孢量的影響先后順序為麥芽糖＞葡萄糖＞蔗糖＞果糖，麥芽糖、葡萄糖明顯優(yōu)于其他碳源，這是因為不同碳源對微生物生長有著不同的影響，能夠為菌體快速吸收利用的碳源有利于活菌數(shù)和孢子產(chǎn)量的提高。由于麥芽糖和葡萄糖對黑曲霉產(chǎn)孢影響效果差別不大，考慮成本因素選取葡萄糖為最適碳源。葡萄糖最優(yōu)質(zhì)量濃度試驗結(jié)果如圖4所示。

圖3 碳源對孢子增殖的影響

圖4 葡萄糖濃度對孢子增殖的影響

當(dāng)葡萄糖濃度為30.0～40.0 g/l時，黑曲霉產(chǎn)孢量呈現(xiàn)上升趨勢；之后隨著添加量的繼續(xù)增大，產(chǎn)孢量開始下降。開始時曲線升高趨勢明顯，這與碳源對黑曲霉的作用方式有關(guān)，增加碳源含量有利于菌體的快速繁殖。但碳源濃度超過40.0 g/l后，由于營養(yǎng)過剩，黑曲霉菌體過大，產(chǎn)孢量明顯減少。因此試驗中選取40.0 g/l為葡萄糖的最適質(zhì)量濃度。

2.2.2 無機氮源的篩選（見圖5～圖6）

從生長角度看，黑曲霉可以利用很多無機氮源，試驗中選取5種常用的無機氮源。由圖5可知，（NH4）2SO4單孢產(chǎn)孢量明顯比其他種類的無機氮源高，單孢產(chǎn)孢量達(dá)6.67×106個，因此本試驗選取（NH4）2SO4作為最適無機氮源。

當(dāng)硫酸銨濃度為3.0 g/l時，單孢產(chǎn)孢量達(dá)到最高為4.56×106個孢子，故本試驗選取3.0 g/l的硫酸銨為最適無機氮源濃度。

圖5 無機氮源對孢子增殖的影響

圖6 硫酸銨濃度對孢子增殖的影響

2.2.3 KH2PO4對孢子增殖的影響（見圖7）

圖7 KH2PO4對孢子增殖的影響

磷酸鹽對微生物產(chǎn)酶的作用是非常重要的，磷是細(xì)胞合成核酸必需的一種元素，也是加快吸收葡萄糖、促進(jìn)細(xì)胞生長不可或缺的一種物質(zhì)。由圖7可知，產(chǎn)孢量隨著KH2PO4質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)KH2PO4濃度為1.5 g/l時單孢產(chǎn)孢量達(dá)到最大，為7.17×106個孢子，繼續(xù)增加KH2PO4濃度產(chǎn)孢開始下降，因此選擇KH2PO4的最適質(zhì)量濃度為1.5 g/l。

2.2.4 硫酸鎂對孢子增殖的影響（見圖8）

圖8 MgSO4對孢子增殖的影響

由圖8可知，當(dāng)MgSO4濃度為1.0 g/l時，單孢產(chǎn)孢量達(dá)到最高，為5.87×106個孢子，但隨著其濃度的繼續(xù)升高，產(chǎn)孢量下降且幅度較大。因此本試驗選取1.0 g/l為MgSO4最適質(zhì)量濃度。

2.2.5 正交試驗

用 L9(34)正交試驗篩選出 KH2PO4、MgSO4、MnCl2、和ZnSO4的最佳配比，結(jié)果見表1。

由表1可知，在KH2PO4、MgSO4、MnCl2和ZnSO4這4種培養(yǎng)基組分的不同配比中，孢子增殖最多的組合為：KH2PO41.5 g/l、MgSO41.0 g/l、MnCl23.0 mg/l、ZnSO415.0 mg/l。極差分析結(jié)果表明，4個因素的影響程度依次為：KH2PO4＞MgSO4＞ZnSO4＞MnCl2。由于理論上優(yōu)化得到的培養(yǎng)基不在正交試驗表中，經(jīng)驗證試驗結(jié)果表明，黑曲霉單孢產(chǎn)孢量達(dá)到7.38×106個，此孢子數(shù)大于正交試驗中出現(xiàn)的所有數(shù)值，驗證了選取該結(jié)果的正確性。由此確定黑曲霉孢子增殖培養(yǎng)基中無機鹽的配比為：KH2PO41.5 g/l、MgSO41.0 g/l、MnCl23.0 mg/l、ZnSO415.0 mg/l。

3 結(jié)論

長期以來，β-葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)特性已為人們所熟悉，大麥中含有較高水平的混合鍵連接的β-葡聚糖多聚體,是造成家禽大麥營養(yǎng)吸收低下的原因。β-葡聚糖酶被廣泛應(yīng)用在飼料工業(yè)中，對提高家畜的生產(chǎn)性能具有重要作用[9]。黑曲霉產(chǎn)孢量及其產(chǎn)孢速度對實現(xiàn)自動化大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)β-葡聚糖酶有重要的影響。本試驗是以產(chǎn)孢量為主要評價標(biāo)準(zhǔn)，對固態(tài)培養(yǎng)黑曲霉孢子的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，分別研究了碳源、氮源、金屬離子以及磷酸鹽對黑曲霉產(chǎn)孢的影響，通過正交試驗進(jìn)一步分析，確定最適培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基體積150 ml/500 ml，接種量103個/瓶；最適培養(yǎng)基：葡萄糖 40.0 g/l、（NH4)2SO43.0 g/l、KH2PO41.5 g/l、MgSO41.0 g/l、MnCl23.0 mg/l、ZnSO415 mg/l、30 ℃培養(yǎng)96 h最終得到黑曲霉單孢產(chǎn)孢量為7.38×106個，優(yōu)化前單孢產(chǎn)孢量為4.102×106個，優(yōu)化后的產(chǎn)孢量是未優(yōu)化條件下的1.8倍，培養(yǎng)時間縮短了72 h。

表1 培養(yǎng)基配方正交試驗結(jié)果及其極差分析

（參考文獻(xiàn)若干篇，刊略，需者可函索）