肉鴨消化道酵母益生菌的分離與鑒定

■張 霞 王學東 李 彪 彭思源 龔阿瓊胡先勤 鄭紅生

（1.武漢輕工大學，湖北武漢 430023；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.武漢市永生鴨業(yè)有限公司，湖北武漢 430077）

“鴨脖”是武漢的一張名片。但當前為了得到更好的經(jīng)濟效益，養(yǎng)殖戶“購一批鴨，拉一車藥”的現(xiàn)象令消費者“恐懼”。藥物的濫用，導致病源微生物耐藥性(drug resistance)不斷增加，而養(yǎng)殖戶往往又通過加大用藥量或使用高效力藥品加以應對，最終導致惡性循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)，從生物防控角度，利用“以菌（益生菌）治菌（致病菌）”的原理預防疾病，可減少各養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的用藥。

國內(nèi)外均在積極尋找抗生素代替品，其中活性益生菌(probiotics)是最具前途的安全生物制劑之一。而酵母菌(saccharomyces cerevisiae)作為益生菌已被許多國家和地區(qū)允許用于動物養(yǎng)殖。酵母菌是一種典型的兼性厭氧型真菌，能夠調(diào)節(jié)胃腸道功能，抑制病原菌。且酵母在胃腸道內(nèi)能保持代謝活性，向腸道分泌多種營養(yǎng)代謝產(chǎn)物，如蛋白質、脂肪、糖及B族維生素等，也可以促進小腸吸收氨基酸[1]。酵母細胞壁內(nèi)層含葡聚糖，這些大分子能激發(fā)非特異性和特異性免疫反應，激活T細胞、B細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞[2]。同時酵母菌有耐受細菌類抗生素作用。理想的益生菌菌株最好來自于腸道。

本研究旨在從肉鴨消化道內(nèi)分離篩選出酵母益生菌，通過26S rDNA分子方法、形態(tài)學和生理生化試驗等鑒定酵母菌的種屬，為開發(fā)高抗性、專一型的酵母益生菌制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

從宜昌肉鴨場、農(nóng)貿(mào)市場（武漢江夏區(qū)）、散養(yǎng)農(nóng)戶（武漢水邊散養(yǎng)）、武漢肉鴨場4個地方分別選取生長良好、健康、表現(xiàn)及精神狀態(tài)好的6只肉鴨(共計24只)。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基、高氏（Gorodkowa）瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、糖發(fā)酵基礎培養(yǎng)基、同化碳源基礎培養(yǎng)基、同化氮源基礎培養(yǎng)基、類淀粉化合物液體培養(yǎng)基、無維生素基礎培養(yǎng)基、尿素分解培養(yǎng)基、無機鹽葡萄糖培養(yǎng)基、高滲透壓培養(yǎng)基。

糖發(fā)酵培養(yǎng)基：D-葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖。

同化碳源培養(yǎng)基：乙醇、麥芽糖、纖維二糖、水楊苷、DL-乳酸、D-阿拉伯糖、棉子糖。

同化氮源培養(yǎng)基：硝酸鉀、L-賴氨酸、尸胺。

無維生素培養(yǎng)基：分別為不含有煙酸、吡哆醇、硫胺素的基礎培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基均為國產(chǎn)的化學純或者分析純試劑。

1.1.3 試劑

山梨醇（Biosharp）、酵母基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech）、Lyticase（Tiangen Biotech）、瓊脂糖、呂氏堿性美蘭染色、克酚紅等均為國產(chǎn)。

1.1.4 儀器設備

單人單面凈化工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備有限公司）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LRHS-150-Ⅱ，上海躍進醫(yī)療器械有限公司）、電泳儀（DYY-8C，北京市六一儀器廠）、PCR儀（TC-XP，BIO-RAD）、凝膠成像儀（Gel DocTMEZ，BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 肉鴨消化道酵母菌的采集與保存

按照解剖學位置，依次從肉鴨的腺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結腸6個部位提取消化道內(nèi)容物，裝入封口袋后4℃保存。

1.2.2 酵母菌的分離純化

取6個部位消化道樣品用平板稀釋法在麥芽汁瓊脂平板上于28℃條件下培養(yǎng)2 d，挑取單菌落進一步用平板劃線法純化2～3次。之后挑取少量純化后的菌體接種于YPD瓊脂斜面上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，然后將其放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹3]。

1.2.3 酵母菌的26S rDNA序列分析[4]

1.2.3.1 酵母基因組DNA提取

用酵母基因組DNA提取試劑盒進行26S rDNA的提取。

1.2.3.2 酵母菌26S rDNA片段擴增和測序

用于26S rDNA PCR反應引物：

上游引物 NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAG?GAAAAG-3'；

下游引物NL4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。

PCR反應體系為50 μl，每管加入10× Taq Buffer 5 μl；20 μmol/l上下游引物各1 μl，2.5 mol/l dNTP 4 μl，模板 DNA 10 μl，5.0 U/μl Taq 0.5 μl。

反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性45 s；55℃退火60 s；72℃延伸70 s，共進行30個PCR循環(huán)，最后再72℃繼續(xù)延伸10 min，4℃保藏。

測序：將純化后的PCR產(chǎn)物送到北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序，所得到的序列與Genbank數(shù)據(jù)庫的基因序列進行同源性比較。

1.2.4 酵母菌的生理生化鑒定

1.2.4.1 酵母菌的形態(tài)學鑒定

依據(jù)田輝艷等[5]的方法進行菌落特征觀察、細胞形態(tài)觀察、擲孢子的形成觀察、菌絲形成觀察和子囊孢子的形成觀察試驗。

1.2.4.2 酵母菌的生理生化鑒定[5-7]

采用糖發(fā)酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗、類淀粉化合物形成試驗、抗放線菌酮試驗、無維生素生長試驗、尿素水解試驗和耐高滲透壓試驗進行酵母菌種屬的鑒定。

2 結果

2.1 肉鴨消化道酵母菌分離結果

不同地區(qū)肉鴨的消化道各個部位分離的酵母菌見表1?？梢姀囊瞬怿唸鋈怿喯?個部位分離出10株酵母菌；農(nóng)貿(mào)市場肉鴨消化道6個部位分離出6株酵母菌；散養(yǎng)農(nóng)戶肉鴨消化道6個部位分離出12株酵母菌；武漢肉鴨場肉鴨消化道6個部位分離出7株酵母菌。本次總共分離得到了35株酵母菌。

2.2 酵母菌26S rDNA分子鑒定結果

2.2.1 酵母菌26S rDNA PCR擴增電泳結果

用酵母基因組DNA提取試劑盒提取酵母菌株的26S rDNA，使用引物NL1、NL4對酵母菌株進行26S rDNA的PCR擴增，結果見圖1～圖4。從圖中可以看出，擴增所得的產(chǎn)物大多在500～600 bp之間。

表1 不同地域肉鴨消化道酵母菌分布情況(株)

圖1 宜昌養(yǎng)殖場肉鴨消化道酵母菌26S rDNA擴增電泳圖譜

圖2 農(nóng)貿(mào)市場肉鴨消化道酵母菌26S rDNA擴增電泳圖譜

圖3 散養(yǎng)農(nóng)戶肉鴨消化道酵母菌26S rDNA擴增電泳圖譜

圖4 武漢養(yǎng)殖場肉鴨消化道酵母菌26S rDNA擴增電泳圖譜

2.2.2 肉鴨各腸段的酵母菌株26S rDNA序列測序結果分析

將測序所得基因序列利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast軟件進行基因序列同源性分析，結果見表2～表5。

表2顯示，從宜昌肉鴨場6只肉鴨消化道分離的10株酵母菌中，Candida albicans6株、Cryptococcus arboriformis1株、Kazachstania bovina2株、Candida parapsilosis1株。

表3顯示，從農(nóng)貿(mào)市場的6只肉鴨消化道分離的6株酵母菌中，Candida albicans2株、Candida parapsilo?sis2株、Lodderomyces elongisporus1株、Kodamaea ohmeri1株。

表4顯示，從散養(yǎng)農(nóng)戶的6只肉鴨消化道分離的12株酵母菌中，Candida albicans1株、Cryptococcus arboriformis1株、Kazachstania bovina2株、Candida parapsilosis4株、Saccharomyces cerevisiae4株。

表5顯示，從武漢肉鴨場6只肉鴨消化道分離的7株酵母菌中，Candida glabrata2株、Candida albicans1株、Saccharomyces cerevisiae3株，Lodderomyces elongispo?rus1株。

表2 宜昌肉鴨場肉鴨消化道酵母菌26S rDNA測序結果分析

表3 農(nóng)貿(mào)市場肉鴨消化道酵母菌26S rDNA測序結果分析

表4 散養(yǎng)農(nóng)戶肉鴨消化道酵母菌26S rDNA測序結果分析

表5 武漢肉鴨場肉鴨消化道酵母菌26S rDNA測序結果分析

綜合表2～表5可知，分離出的35株酵母菌長度在500～650 bp之間，與模式菌株的基因序列同源性都在99%或100%。其中Candida albicans10株、Crypto?coccus arboriformis2株、Kazachstania bovina4株、Candida parapsilosis7株、Lodderomyces elongisporus2株、Kodamaea ohmeri 1株、Candida glabrata2株、Sac?charomyces cerevisiae7株。

由于目前的飼用酵母菌株中，只有釀酒酵母屬（Saccharomyces cerevisiae）是可以安全使用的，所以將分離的7株釀酒酵母編號為Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7進行進一步的鑒定。

2.2.3 釀酒酵母菌株菌落形態(tài)及生理生化鑒定結果（見表6、表7）

由表6可知，Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7菌株菌落都為乳白色，菌株大多為圓形或卵圓形，其無性繁殖方式為出芽生殖；Y-2、Y-4、Y-6、Y-7菌株均有假菌絲，都不產(chǎn)生擲孢子；子囊內(nèi)有1～2個光滑的圓形或卵圓形子囊孢子。

表6 7株釀酒酵母的形態(tài)學特征

表7 7株釀酒酵母的生理生化試驗結果

從表7可知，7株菌都能發(fā)酵D-葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，都不能發(fā)酵乳糖。只有Y-4不能發(fā)酵半乳糖，其他菌株都能發(fā)酵，而Y-2和Y-6不能發(fā)酵蜜二糖，其他菌株都能發(fā)酵。碳源同化實驗中都不能同化纖維二糖、水楊苷、D-阿拉伯糖、木糖醇、檸檬酸鹽和甲醇，Y-4不能同化乙醇，能同化蔗糖，其他菌株相反；只有Y-3菌株能同化D-半乳糖，其他菌株不能，麥芽糖、DL-乳酸、棉子糖都是有些菌株可以同化，有些不能同化。氮源同化試驗中，7株菌都不能同化硝酸鉀、L-賴氨酸、尸胺。無維生素試驗生長試驗中，無煙酸試驗都顯陽性，無吡哆醇試驗中Y-2、Y-3、Y-6顯陽性，其他幾株菌顯陰性；無硫胺素試驗則是Y-2、Y-4、Y-5顯陽性，其他顯陰性。另外，在0.01%放線菌酮試驗、類淀粉化合物形成試驗、尿素分解試驗和50%D-葡萄糖生長試驗中，7株菌都顯陰性。

根據(jù)《Yeasts Characteristies and Identification》[8]中所提供的檢索方法來進行生理生化鑒定，其形態(tài)學、生理生化特性符合釀酒酵母屬特性。

3 討論

酵母益生菌是重要的飼用益生菌之一，其耐受腸道pH值變化，能調(diào)節(jié)腸道環(huán)境微生態(tài)平衡，提高動物機體免疫能力。一般認為，理想的益生菌菌株最佳來源為原籍動物腸道。國內(nèi)關于腸道酵母益生菌的分離、鑒定的研究較少。魏亞松等[9]從水貂腸道分離出了2株酵母菌；胡秀彩等[10]和呂愛軍等[11]都從斑馬魚腸道中分離出酵母菌；張可毅等[12]將雞腸道分離的一株假絲酵母經(jīng)批量培養(yǎng)后飼喂肉雞，對肉雞生長具有促進作用；田輝艷等[5]、周平[3]等分離了豬腸道酵母菌。而對肉鴨腸道酵母益生菌的分離、鑒定研究未見報道。本研究從4個不同地域采集健康成年肉鴨消化道6個腸段（胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸)內(nèi)容物分離酵母菌，共分離出了35株酵母菌。

經(jīng)常能從宿主體內(nèi)分離到的菌株，而且數(shù)目較多，被稱為常住菌，又叫原籍菌群。反之，不能經(jīng)常從機體分離出來的菌株為過路菌。本研究從4個不同地域肉鴨消化道采集的樣品，胃中雖都分離出了酵母菌，但是數(shù)量很少，其他消化道如十二指腸只有從散養(yǎng)農(nóng)戶肉鴨消化道采集的樣品分離出了酵母菌，回腸從宜昌肉鴨場、農(nóng)貿(mào)市場、散養(yǎng)農(nóng)戶肉鴨消化道采集的樣品都分離出酵母菌，但從武漢肉鴨場采集的樣品未分離出酵母菌，結腸只有從宜昌肉鴨場肉鴨消化道采集的樣品才分離出酵母菌，其他幾個地域采集的樣品都未分離出酵母菌，且數(shù)量都很少，證明酵母菌能耐受肉鴨消化道環(huán)境，但是在消化道中為過路菌。

Kurztman等[13-14]測定了所有已知酵母種類的26S rDNA的D1/D2區(qū)域序列，發(fā)現(xiàn)這段區(qū)域序列變異性較高，且同一菌種在這個區(qū)域替代率一般不大于1%，而不同種的菌株差異更大，由此可以將絕大部分種區(qū)分開。趙麗麗等[15]從葡萄、蘋果等樣品中分離出的18株酵母進行26S rDNA D1/D2區(qū)域堿基序列分析，與基因庫中的基因序列進行比對，同源性99%或100%，說明此方法可以實現(xiàn)酵母菌種級水平鑒定。楊艷艷等[16]從工業(yè)污水處理池中分離耐堿酵母菌，通過26S rDNA 5’端D1/D2區(qū)基因序列分析，同源性為99.8%。

本試驗對分離的酵母菌進行26Sr DNA的D1/D2區(qū)段基因序列測定，與Genbank數(shù)據(jù)庫基因序列進行比對，同源性均在99%或100%。分離出的35株酵母菌分別為Candida albicans10株、Cryptococcus arbori?formis2株、Kazachstania bovina4株、Candida parapsi?losis7株、Lodderomyces elongisporus2株、Kodamaea ohmeri1株、Candida glabrata2株、Saccharomyces cerevisiae7株。對7株釀酒酵母進行形態(tài)學和生理生化試驗，進一步驗證26S rDNA的分析結果。根據(jù)農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄（2013）》征求意見稿中所列釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是屬于允許添加的飼用微生物。

4 結論

從4個不同地域的肉鴨消化道的6個部位共分離出35株酵母菌，其中有7株為釀酒酵母菌，這些菌株可作為肉鴨專用飼用酵母益生菌的備選菌株。