糖尿病腎病的足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及其干預(yù)研究現(xiàn)狀

侯鵬超　洪郁芝　葉迅

[摘要] 糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病微血管病變中最常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，近年來DN逐步成為終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）的首要原因，但是DN的發(fā)病機(jī)制迄今為止尚未完全闡明。蛋白尿是DN的主要臨床特征，也是導(dǎo)致DN惡性進(jìn)展的重要因素。近年研究認(rèn)為，足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化可能是導(dǎo)致DN早期蛋白尿形成的關(guān)鍵因素?；诖?，本文對(duì)足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)生物學(xué)特點(diǎn)、信號(hào)通路、與蛋白尿之間關(guān)系以及纈沙坦和雷公藤內(nèi)酯醇干預(yù)表型轉(zhuǎn)化可能存在的機(jī)制進(jìn)行綜述。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病腎??；足細(xì)胞；表型轉(zhuǎn)化；纈沙坦；雷公藤內(nèi)酯醇

[中圖分類號(hào)] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）35-0157-04

DN是糖尿病常見和嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，研究顯示DN的發(fā)生率在病程10年以上的1型糖尿病患者中占到30%～40%，是1型糖尿病的首位死亡原因；其在2型糖尿病患者中發(fā)生率約為20%，是僅次于心、腦血管動(dòng)脈粥樣硬化之后的死因[1]。近20年來DN的發(fā)病率呈增高趨勢(shì)，DN在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家占ESRD的25%～42%，在發(fā)展中國(guó)家如印度超過了0.8%[2]，在中國(guó)更達(dá)到了13.5%。部分大中城市DN導(dǎo)致的ESRD已經(jīng)成為透析人群的首位原因[3]。DN的基本病理改變是腎小球增大，系膜細(xì)胞增生，基底膜增厚和細(xì)胞外基質(zhì)在腎小球、腎小管聚集，從而引起腎小球高濾過和蛋白尿，最終導(dǎo)致進(jìn)行性腎小球硬化和腎小管-間質(zhì)纖維化[4]。

1 糖尿病腎病與蛋白尿

DN早期表現(xiàn)為微量白蛋白尿，然后出現(xiàn)大量蛋白尿，最終發(fā)展成ESRD。蛋白尿是DN的主要臨床表現(xiàn)，也是DN進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。蛋白尿本身可以加重腎小球硬化和腎小管-間質(zhì)纖維化，蛋白的濾過和重吸收引起炎癥和血管活性物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致纖維增生、間質(zhì)炎癥和系膜細(xì)胞損傷。研究顯示，只要蛋白尿的水平下降50%，ESRD的危險(xiǎn)性就能下降61%。因此探討蛋白尿發(fā)生機(jī)制具有非常重要的臨床意義[5]。目前研究認(rèn)為，DN蛋白尿的發(fā)生機(jī)制除了腎小球血液動(dòng)力學(xué)異常、腎小管-間質(zhì)的損傷、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)作用和晚期糖基化終末產(chǎn)物與循環(huán)蛋白交聯(lián)等因素外，腎小球?yàn)V過膜的破壞成為DN蛋白尿生成的首要原因[6]。近五年來，濾過膜最外層-腎小球足細(xì)胞（podocyte）的研究逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

足細(xì)胞是位于腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）外高度分化的上皮細(xì)胞，它與GBM、毛細(xì)血管內(nèi)皮三者組成了腎小球?yàn)V過膜屏障。足細(xì)胞鄰近的足突相互交叉連接形成柵欄狀結(jié)構(gòu)為裂孔，直徑約4～11 nm，孔上覆蓋一層厚4～6 nm 的裂孔隔膜，稱為腎小球足突間裂孔隔膜（glomeroular basement membrance，GPSD），其組成的蛋白主要有nephrin、podocin、CD2AP和ZO-1等，GPSD和其表面帶負(fù)電荷的唾液酸糖蛋白共同組成了機(jī)械屏障和電荷屏障[7-9]。GPSD是阻止血漿蛋白濾出的最后屏障，在維系腎小球?yàn)V過膜的完整性中發(fā)揮重要作用。國(guó)外許多糖尿病動(dòng)物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已經(jīng)提示高糖會(huì)引起足細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，從而導(dǎo)致DN蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展[10]。足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化已成為近年來研究蛋白尿形成和腎臟纖維化機(jī)制的熱點(diǎn)。

2糖尿病腎病的足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化

2.1足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化概況

足細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化是指在持續(xù)低強(qiáng)度、進(jìn)行性的有害刺激誘導(dǎo)下，足細(xì)胞可由上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），導(dǎo)致足細(xì)胞的上皮特異性喪失而失去功能，而轉(zhuǎn)換成的間充質(zhì)細(xì)胞，成為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular cell matrix，ECM）產(chǎn)生大量纖維細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞。該過程即足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化（phenotypic transformation），導(dǎo)致足細(xì)胞的受損和濾過屏障的破壞，形成蛋白尿[11，12]，最終導(dǎo)致進(jìn)行性腎小球硬化和腎小管-間質(zhì)纖維化。越來越多的研究顯示，足細(xì)胞EMT可能是導(dǎo)致足細(xì)胞功能喪失、大量蛋白尿及腎小球硬化的共同起始途徑[13]。

2.2足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的生物學(xué)特點(diǎn)

足細(xì)胞發(fā)生EMT的證據(jù)，可由蛋白標(biāo)志物的改變體現(xiàn)，如上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白nephrin、podocin、NEPH1、CD2AP、ZO-1和P-cadherin等的表達(dá)減少，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin、ILK、FN、MMP-9和FSP-1等表達(dá)增加，提示了轉(zhuǎn)分化的發(fā)生[14，15]。這類標(biāo)志物的波動(dòng)已在實(shí)驗(yàn)中獲得了部分證明。Wu Y等[16]研究發(fā)現(xiàn)，利用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)產(chǎn)生的糖尿病大鼠，腎小球nephrin、podocin的表達(dá)均明顯低于正常對(duì)照組。Gagliardini E等[17]在STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠足細(xì)胞和高糖體外培養(yǎng)的足細(xì)胞進(jìn)行nephrin檢測(cè)，同樣出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。Zou等[18]在腎病綜合征大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞的desmin，vimentin和nestin蛋白表達(dá)明顯上升，提示可能發(fā)生了EMT。Yamaguchi等[19]觀察2型糖尿病患者109例，并對(duì)其中43例進(jìn)行了腎穿刺活檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者尿液和腎組織中足細(xì)胞的FSP-l、FN的表達(dá)均明顯升高，也提示了間充質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)活躍的事實(shí)依據(jù)。

2.3介導(dǎo)足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的TGF-β/smad信號(hào)通路

研究認(rèn)為足細(xì)胞EMT的發(fā)生主要有三條信號(hào)通路介導(dǎo)，即TGF-β/smad，integrin/ILK和Wnt/β-catenin通路，這些通路交互成錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同參與和調(diào)控EMT所需要的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)信號(hào)[20，21]。若能清楚理解這些信號(hào)通路作用機(jī)制并加以阻斷主要通路，將會(huì)有效逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞的EMT而靶向保護(hù)足細(xì)胞[22，23]。endprint

目前證據(jù)顯示，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）是誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生EMT的主要介質(zhì)，其在多種以蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)的腎臟疾病中均被特異性激活，進(jìn)而促進(jìn)了足細(xì)胞EMT的發(fā)生[20，24，25]。有研究用TGF-β刺激體外培養(yǎng)的足細(xì)胞，nephrin、ZO-1的表達(dá)明顯下調(diào)，而desmin、FN、collagenⅠ、MMP-9的表達(dá)顯著上調(diào)。Lee H S[26]的研究認(rèn)為，使用TGF-β誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞均發(fā)生了EMT改變，而纖維化小鼠模型和DN患者的足細(xì)胞普遍存在TGF-β上調(diào)，這提示了TGF-β可能與足細(xì)胞EMT以及腎臟纖維化相關(guān)顯著。

目前研究認(rèn)為高糖主要是通過上調(diào)TGF-β來激活TGF-β-Smad-MAPK途徑導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[27]。Cheng X等對(duì)DN大鼠進(jìn)行6周的尾靜脈高糖注射后發(fā)現(xiàn)，與未注射組相比，TGF-β1表達(dá)顯著上調(diào)，p-Smad2的表達(dá)則是后者的兩倍[28]。其次認(rèn)為高糖在上調(diào)TGF-β的同時(shí)下調(diào)Smad7的表達(dá)，Smad7認(rèn)為是在TGF-β-Smad-MAPK信號(hào)通路中起負(fù)反饋?zhàn)饔?，一旦Smad7的表達(dá)減少，TGF-β-Smad-MAPK通路活性就會(huì)增強(qiáng)，腎臟表現(xiàn)為進(jìn)展性纖維化[29，30]。Chen H Y等[31]在Smad7基因敲除的DN小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，與未敲除組相比，微量蛋白尿明顯增加，腎臟炎癥和纖維化明顯，并同時(shí)伴有TGF-β/Smad2/3 和NF-ΚB信號(hào)通路的激活。

2.4糖尿病腎病足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與蛋白尿的發(fā)生

最近研究表明，足細(xì)胞EMT與蛋白尿之間存在密切且復(fù)雜的關(guān)系。DN中高糖為主要的誘導(dǎo)因素，在持續(xù)的低強(qiáng)度、進(jìn)行性刺激下，足細(xì)胞將啟動(dòng)EMT，表達(dá)上皮細(xì)胞樣表型標(biāo)志物的足細(xì)胞減少和表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物的足細(xì)胞增多，發(fā)生EMT的足細(xì)胞活性減低、衰退以及正常功能喪失，足突分叉減少消失、融合增加，與GBM的粘附能力降低，這使得腎小球?yàn)V過膜受損，形成早期蛋白尿[12]。另一方面，轉(zhuǎn)換成的間充質(zhì)細(xì)胞成為細(xì)胞外基質(zhì)的成纖維細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞的重要來源，進(jìn)一步加重腎小管間質(zhì)纖維化[32]。而長(zhǎng)時(shí)間和強(qiáng)烈有害的高糖刺激，除了加重足細(xì)胞EMT，還可導(dǎo)致足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和細(xì)胞的凋亡，從GBM發(fā)生脫落，由于足細(xì)胞只有有限的增殖能力，當(dāng)大量足細(xì)胞從GBM上脫落后，剩下的足細(xì)胞將無法填補(bǔ)缺失，這導(dǎo)致了腎小球?yàn)V過膜的通透性進(jìn)一步增加，形成晚期大量蛋白尿。與此同時(shí)轉(zhuǎn)分化形成的間充質(zhì)細(xì)胞成為ECM而大量堆積，這將加速腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的形成[20，33]。

以往研究顯示足細(xì)胞的數(shù)量與早期蛋白尿密切相關(guān)，足細(xì)胞脫落和凋亡將直接導(dǎo)致早期蛋白尿的產(chǎn)生。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)大量足細(xì)胞的凋亡和脫落明顯落后于蛋白尿的產(chǎn)生，在糖尿病大鼠模型中出現(xiàn)微量白蛋白尿時(shí)，足細(xì)胞的數(shù)目并未出現(xiàn)明顯的減少[34]。Liu[35]的研究證實(shí)，早期蛋白尿形成可能與足細(xì)胞EMT有關(guān)，而后期大量蛋白尿形成則與足細(xì)胞脫落和凋亡有關(guān)。同時(shí)研究認(rèn)為，EMT是足細(xì)胞損傷后發(fā)生一系列反應(yīng)中一個(gè)可逆的過程，若在DN早期去除高糖等損傷相關(guān)因素或者直接干預(yù)EMT，足細(xì)胞可能出現(xiàn)恢復(fù)，而并不進(jìn)一步發(fā)展成凋亡和脫落，從而阻止早期蛋白尿的進(jìn)展。

3 纈沙坦干預(yù)足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的研究

目前公認(rèn)有效地保護(hù)足細(xì)胞的藥物是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑（RAS抑制劑）。以往的研究認(rèn)為RAS抑制劑通過長(zhǎng)期有效的血壓控制可減低腎小球?yàn)V過率的下降速度，降低腎小球內(nèi)壓，達(dá)到減輕DN患者蛋白尿的目的[36，37]。

但目前的研究發(fā)現(xiàn)ANGⅡ是誘導(dǎo)EMT的強(qiáng)激動(dòng)劑，并且選擇性阻斷AT1和AT2受體不能抑制ANGⅡ誘導(dǎo)EMT，反而通過增加ANG1-7的合成，促進(jìn)EMT[38]。纈沙坦（Valsartan，Val）是選擇性AT1受體阻斷劑，以往的研究已經(jīng)證實(shí)纈沙坦能促使DN大鼠足細(xì)胞nephrin、ZO-1上調(diào)， FSP-1、desmin的下調(diào)，進(jìn)而改善腎功能和腎臟病變[39]。Tominaga N等在高血壓合并DN的大鼠實(shí)驗(yàn)中，利用不同劑量的纈沙坦觀察大鼠血壓和蛋白尿的變化，當(dāng)纈沙坦超過120 mg/（kg·d）時(shí)，血壓不再出現(xiàn)額外的下降，而蛋白尿卻持續(xù)減低[40]。因此目前認(rèn)為其降低蛋白尿的機(jī)制除了通過抑制RAS、降低腎小球內(nèi)壓之外，可能存在通過保護(hù)足細(xì)胞損傷的非RAS途徑[41]。纈沙坦是否通過對(duì)足細(xì)胞EMT的調(diào)節(jié)作用保護(hù)受損的足細(xì)胞目前尚未完全清楚。

4雷公藤內(nèi)酯醇干預(yù)足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的研究

雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TP）是雷公藤生物中活性最強(qiáng)的單體。近期研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用TP可保護(hù)體內(nèi)外嘌呤霉素氨基核苷誘導(dǎo)的足細(xì)胞損害，可顯著減少誘導(dǎo)的大鼠模型蛋白尿，且該作用不依賴腎小球?yàn)V過率下降。該研究還發(fā)現(xiàn)蛋白尿的降低與足突融合的改善、desmin下調(diào)、nephrin、podocin恢復(fù)存在密切關(guān)系，TP可阻止嘌呤霉素誘導(dǎo)的小鼠模型足細(xì)胞actin細(xì)胞骨架和微絲相關(guān)的突觸極蛋白損傷，TP還能保護(hù)足細(xì)胞免受C5b-9介導(dǎo)的損傷并減輕蛋白尿[42]。但TP的這種對(duì)足細(xì)胞保護(hù)作用是否通過上調(diào)高糖誘導(dǎo)下Smad7表達(dá)減少，從而抑制TGF-β-Smad-MAPK信號(hào)通路的活化，在糖尿病腎病早期抑制甚至逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞的EMT，目前尚存在研究的空白。

5展望

足細(xì)胞EMT為腎臟疾病中足細(xì)胞與蛋白尿的關(guān)系提供了全新的解釋。但在DN蛋白尿發(fā)生發(fā)展過程中，足細(xì)胞EMT究竟起什么作用，調(diào)節(jié)EMT的信號(hào)通路在高糖環(huán)境下發(fā)揮怎樣的調(diào)控作用，目前仍有爭(zhēng)議。體內(nèi)外的研究表明雷公藤內(nèi)酯醇和RAS抑制劑纈沙坦極有可能通過緩解足細(xì)胞EMT而減輕DN蛋白尿，但對(duì)其靶向保護(hù)足細(xì)胞的具體機(jī)制仍然存在許多空白和爭(zhēng)議。通過觀察雷公藤內(nèi)酯醇和纈沙坦干預(yù)體外高糖環(huán)境下足細(xì)胞EMT及其調(diào)節(jié)EMT的信號(hào)通路，將有利于深入探討DN足細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的發(fā)生機(jī)制，并且為其保護(hù)足細(xì)胞、降低蛋白尿和延緩DN進(jìn)展提供嶄新的分子生物學(xué)依據(jù)。endprint