裸花紫珠膠囊質(zhì)量標準研究

鄭東昆， 陳偉康， 黃 波，崇 嵐， 羅躍華*

（1.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330006；2.江西省食品藥品檢驗所，江西南昌330046；3.南昌市食品化妝品監(jiān)督所，江西南昌330038）

［質(zhì) 量］

裸花紫珠膠囊質(zhì)量標準研究

鄭東昆1，2， 陳偉康2， 黃 波1，2，崇 嵐3， 羅躍華1，2*

（1.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330006；2.江西省食品藥品檢驗所，江西南昌330046；3.南昌市食品化妝品監(jiān)督所，江西南昌330038）

目的建立裸花紫珠膠囊的質(zhì)量標準。方法采用薄層色譜法 （TLC）對膠囊中裸花紫珠進行定性鑒別；采用超高效液相色譜法（UHPLC），Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm），同時對制劑中木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷進行定量測定。結(jié)果薄層鑒別專屬性強，斑點清晰，分離度好；木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷分別在1.79～89.69μg/m L（r=0.999 9）、8.45～422.45μg/mL（r=0.999 9）、14.48～724.14μg/mL（r=0.999 8）、14.12～706.11μg/mL（r=0.999 9）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率 （n=9）分別為98.1%、101.3%、98.4%、102.0%，RSD分別為1.2%、1.5%、1.3%、1.5%。結(jié)論所建立的定性、定量分析方法簡便快速，準確度高，能夠有效控制裸花紫珠膠囊的質(zhì)量。

裸花紫珠膠囊；質(zhì)量標準；TLC；UHPLC；木犀草苷；連翹酯苷B；毛蕊花糖苷；異毛蕊花糖苷

裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.為馬鞭草科紫珠屬植物，是海南黎族醫(yī)生常用藥材之一［1］，其枝葉具有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消腫、驅(qū)風(fēng)祛濕之功效［2］。裸花紫珠膠囊為裸花紫珠干浸膏制成的單味制劑，主要用于細菌感染引起的炎癥，急性傳染性肝炎，呼吸道和消化道出血等［3-5］。裸花紫珠膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標準［6］鑒別項為化學(xué)鑒別，專屬性不強，因此建立薄層色譜法對其中裸花紫珠進行定性鑒別；現(xiàn)行標準采用紫外分光光度法測定裸花紫珠膠囊中總黃酮的量，同樣缺乏專屬性。近年研究表明，裸花紫珠中黃酮類成分木犀草苷具有抗菌、消炎、止血作用［7-8］；而苯乙醇苷類成分毛蕊花糖苷可能是裸花紫珠止血作用的主要活性成分［9］，其同分異構(gòu)體異毛蕊花糖苷具有抑制體外溶血及抗氧化作用［10-11］，連翹酯苷B具有抗炎、抗菌作用［12-13］。以上4個成分在裸花紫珠膠囊中含有量較高，且藥理活性均在裸花紫珠膠囊的臨床應(yīng)用上有所體現(xiàn)。因此，建立同時定量測定裸花紫珠膠囊中以上4個有效成分的方法，可對裸花紫珠膠囊的質(zhì)量進行控制。通過建立簡單、可靠的裸花紫珠薄層鑒別和成分定量測定方法，可改變現(xiàn)行裸花紫珠膠囊質(zhì)量標準薄層鑒別與成分定量測定項專屬性不強的現(xiàn)狀。

1 儀器與試藥

Agilent1290系列高效液相色譜儀（G4220A二元泵，G1316C柱溫箱，G4226A全自動進樣器；G4212A二極管陣列檢測器）；色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；自制硅膠薄層板 （0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板）；Sartorius BSA124S-CW電子天平；Sartorius BT 25S電子天平。對照藥材裸花紫珠（批號 121582-201001），對照品木犀草苷 （批號11720-201106）、連翹酯苷 B（批號 111811-201102）、毛蕊花糖苷對照品 （批號1530-200202）均購于中國食品藥品檢定研究院。異毛蕊花糖苷對照品由江西省食品藥品檢驗檢測研究院從裸花紫珠中分離制備得到，由MS、1H-NMR和13C-NMR鑒定結(jié)構(gòu)，通過面積歸一化法計算純度為98.3%。裸花紫珠膠囊分別由江西杏林白馬藥業(yè)有限公司（批號分別為20130403、20130409、20130712）和海南九芝堂藥業(yè)有限公司 （批號分別為130012、130022、140012）提供，水為Millipore制備的超純水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 取本品內(nèi)容物1 g，加水150 m L，煎煮，保持微沸1 h，放冷，離心，取上清液加氯化鈉5 g，振搖使溶解，溶液加乙酸乙酯40 mL振搖提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按照制劑處方工藝制備缺少裸花紫珠的陰性樣品，取其內(nèi)容物1 g，按供試品溶液制備方法同法制成陰性對照溶液；另取裸花紫珠對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法 （《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各10～20μL，分別點于同一用0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨水 （17：2：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃加熱5 min，置紫外光燈 （365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點；陰性對照溶液無干擾，見圖1。

圖1 裸花紫珠膠囊的TLCFig.1 TLC chromatogram of Luohua Zizhu Capsules

2.2 成分測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈 （A）-0.1%甲酸 （B），梯度洗脫（0～1.0 min，10.0%A；1.0～12.0 min，10.0%～16.5%A；12.0～15.0 min，16.5%～50%A；15.0～18.0 min，50%A）；體積流量0.5 mL/min；檢測波長350 nm；柱溫40℃；進樣量1 μL。該條件下木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷與相鄰峰分離度均大于1.5，裸花紫珠膠囊陰性樣品無干擾。色譜圖見圖2。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別稱取木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，置同一100 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 m L含木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷分別為0.18、0.84、1.45、1.41 mg的混合對照品貯備液。精密量取上述貯備液10 mL置50 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

圖2 UHPLC色譜圖Fig.2 UHPLC chromatogram s

2.2.3 供試品溶液的制備 將本品內(nèi)容物研細后，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理 （功率500 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取缺裸花紫珠的陰性樣品0.5 g，同法制成裸花紫珠陰性對照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.2.2”項下混合對照品貯備液0.5、1、2.5、5、10、25 mL，分別置50 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得6個系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，在上述色譜條件下進樣測定。以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標 （X），峰面積為縱坐標 （Y），采用Microsoft?Office Excel 2007擬合標準曲線，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見表1。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液1μL，按以上色譜條件重復(fù)測定6次，并記錄峰面積，結(jié)果木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的峰面積的RSD分別為1.5%、1.3%、0.9%、0.8%，表明儀器精密度良好。

表1 4個成分標準曲線測定結(jié)果Tab.1 Determ ination results of standard curve of four constituents

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液 （批號20130409），在室溫放置0、2、4、8、12、24 h后分別進樣，記錄色譜峰面積，結(jié)果木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的RSD值分別為1.4%、1.9%、1.0%、1.2%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)測定結(jié)果基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同一批號 （批號20130409）樣品，精密稱取6份，按 “2.2.3”項下制備方法制備供試品溶液并測定。結(jié)果木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的平均含有量分別為 1.30、14.23、19.38、18.75 mg/g。RSD分別為1.2%、0.5%、0.7%、0.8%。結(jié)果表明該法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收試驗 取已知含有量裸花紫珠膠囊 （批號20130409）的樣品粉末約0.25 g，精密稱定，共9份，分別精密加入相當于樣品中各成分含有量的80%、100%、120%的混合對照品溶液（木犀草苷13.00μg/mL，連翹酯苷B 142.28 μg/mL，毛蕊花糖苷193.76μg/mL，異毛蕊花糖苷187.44μg/mL）20、25、30 mL，每個水平各3份，然后分別精密加入70%甲醇30、25、20 m L。按 “2.2.3”項下方法制備供試液，在上述色譜條件下進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果表明：該法測定結(jié)果的準確度較高。結(jié)果見表2。

2.2.10 樣品測定 取裸花紫珠膠囊6批，按“2.2.3”項下制備方法，每批制備供試品溶液3份，并在以上色譜條件下進樣測定，記錄峰面積值，計算樣品中木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷的量，測定結(jié)果見表3。

3 討論

裸花紫珠膠囊的薄層色譜鑒別中考察了不同展開劑、不同薄層板、不同溫度、不同濕度等展開條件，最終確定的方法具有較好的重復(fù)性和專屬性，可快速有效地對裸花紫珠膠囊質(zhì)量進行控制。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests（n=9）

表3 樣品測定結(jié)果（n=3）Tab.3 Determ ination of sam p les（n=3）

UHPLC對成分較復(fù)雜的中藥具有良好的分離效果并能大大縮短樣品的分析時間。本實驗采用UHPLC法測定樣品中木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷，實驗結(jié)果表明該法操作簡單、準確、重復(fù)性好，具有分離效果好，分析時間短的優(yōu)點。

通過DAD檢測器對供試品色譜400～200 nm進行光譜掃描，結(jié)果顯示木犀草苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷最大吸收波長分別為350 nm、330 nm、330 nm、330 nm。由于裸花紫珠膠囊中木犀草苷含有量較低，為了顧及木犀草苷的檢測準確度，故選擇以350 nm為檢測波長，此波長下4個成分均可得到滿意的靈敏度。同時考察了不同提取方法 （超聲、回流），不同提取時間（20 min、30 min、40 min、50 min），不同提取溶劑 （甲醇、70%甲醇、乙醇，70%乙醇）以及不同溶劑用量（25 m L、50 mL、100 mL）對提取效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用50mL 70%甲醇超聲處理40 min條件下裸花紫珠膠囊中4個有效成分的提取效果最佳。

本實驗所建立的裸花紫珠膠囊質(zhì)量標準薄層鑒別專屬性強，斑點清晰，分離度好；成分定量測定分析時間短，準確度高，重復(fù)性好。較現(xiàn)行裸花紫珠膠囊標準有較大提高，可用于裸花紫珠膠囊的質(zhì)量控制。

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Quality standard for Luohua Zizhu Capsules

ZHENG Dong-kun1，2， CHENWei-kang2， HUANG Bo1，2， CHONG Lan3， LUO Yue-hua1，2*
（1.School of Pharmacy，Nanchang University，Nanchang 330006，China；2.Jiangxi Provincial Institute for Food and Drug Control，Nanchang 330029，China；3.Food&Cosmetics Supervisory Organization of Nanchang City，Nanchang 330038，China）

AIMTo establish the quality standard for Luohua Zizhu Capsules.METHODSCallicarpa nudiflora Hook in capsuleswas identified by TLC.The contents of luteoloside，forsythoside B，acteoside and isoacteoside in capsules were determined by UHPLC.RESULTSTLC spots were clear and well-separated.Luteoloside，forsythoside B，acteoside and isoacteoside showed good linearity in the ranges of1.79-89.69μg/mL（r= 0.999 9），8.45-422.45μg/mL（r=0.999 9），14.48-724.14μg/mL（r=0.999 8），14.12-706.11 μg/mL（r=0.999 9），respectively.The average recoveries of luteoloside，forsythoside B，acteoside and isoacteoside were 98.1%，101.3%，98.4%and 102.0%，respectively.The RSDs were 1.2%（n=9），1.5%（n= 9），1.3%（n=9）and 1.5%（n=9），respectively.CONCLUSIONThe established qualitative and quantitativemethods are simple and accurate，which can be used for the quality control of Luohua Zizhu Capsules.

Luohua Zizhu Capsules；quality standard；TLC，UHPLC；luteoloside；forsythoside B；acteoside；isoacteoside

R927.2

A

1001-1528（2015）04-0774-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.017

2014-09-29

國家自然科學(xué)基金資助項目 （81373955）；中國食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金課題 （2013WA9）

鄭東昆 （1987―），女，碩士生，從事藥物分析研究。Tel：18146622300，E-mail：329747454@qq.com

*通信作者：羅躍華，男，主任中藥師，從事藥物分析研究。Tel：（0791）88158689，E-mail：emailluo@sohu.com