單葉蔓荊子提取工藝研究

張金蓮， 李志強， 余書琦， 曾昭君， 陳 香

（江西中醫(yī)藥大學，江西南昌330004）

單葉蔓荊子提取工藝研究

張金蓮， 李志強， 余書琦， 曾昭君， 陳 香

（江西中醫(yī)藥大學，江西南昌330004）

目的優(yōu)化單葉蔓荊子的提取工藝。方法在優(yōu)化提取溫度和時間的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交表，以乙醇體積分數(shù)、乙醇用量、粉碎度和提取次數(shù)為考查因素，以浸膏得率、總黃酮含有量和蔓荊子黃素含有量為考查指標，采用綜合加權(quán)評分法對測定結(jié)果進行分析。結(jié)果優(yōu)化后的提取工藝為藥材經(jīng)粉碎機粉碎，過40目篩，加8倍量50%的乙醇，提取時間1 h，提取3次。結(jié)論該方法可行、穩(wěn)定。

單葉蔓荊子；提取工藝；綜合加權(quán)評分法；正交設(shè)計

蔓荊子為常用中藥，以 “蔓荊實”之名始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［1］，為馬鞭草科植物單葉蔓荊Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.或蔓荊Vitex trifolia L.的干燥成熟果實，有疏散風熱、清利頭目之功效［2］。該植物主產(chǎn)于我國江西、山東、浙江、安徽、福建等地［3-4］，臨床上常用于治療風熱感冒頭痛、齒齦腫痛、目赤多淚、頭暈?zāi)垦?，尤其在治療以頭痛為主的多種疼痛癥狀方面療效顯著［5-6］。黃酮類化合物是蔓荊子鎮(zhèn)痛、抗菌、消炎等藥理作用的主要藥效成分［7-10］，其中蔓荊子黃素含有量是衡量其優(yōu)劣的重要依據(jù)［2］。但中藥的藥效是多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果，故本實驗以江西主產(chǎn)的單葉蔓荊子為研究對象，以浸膏得率、總黃酮含有量和蔓荊子黃素含有量為評價指標，優(yōu)選該中藥的提取工藝。

1 儀器和材料

1.1 儀器 ultimate 3000高效液相色譜儀，包括ultimate 3000自動進樣器、ultimate 3000柱溫箱、ultimate 3000色譜工作站（美國Thermo Fisher Scientific公司）；UV-2550型紫外分光光度計（日本島津儀器公司）；Sartorius BS124電子天平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 （國華電器有限公司）；高速萬能粉碎機 （天津市泰斯特一儀器有限公司）；SZ-93自動雙重純水蒸餾器 （上海亞榮生化儀器廠）；KQ3200超聲波清洗器 （昆山超聲儀器廠）；GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）。

1.2 對照品及試劑 蔓荊子黃素對照品 （中國藥品生物制品檢定所，批號111554-200503）；蘆丁對照品 （四川維克奇生物科技有限公司）。分析純亞硝酸鈉 （天津市大茂化學試劑廠）；分析純硝酸鋁 （西隴化工股份有限公司）；分析純氫氧化鈉 （天津市恒興化學試劑制造有限公司）；色譜純甲醇 （美國Merck公司）；水為超純水 （自制）；其他試劑均為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 實驗藥材 單葉蔓荊子購自江西新建縣厚田鎮(zhèn)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學中藥資源學科組賴學文副教授鑒定為馬鞭草科植物單葉蔓荊Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.的干燥成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸膏得率 精密稱取10 g單葉蔓荊子 （M），按L9（34）正交試驗表中的條件進行提取，然后合并提取液，過濾，置于恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴上濃縮蒸干，得到蔓荊子提取物 （m）。按 《中國藥典》2010版ⅨH水分測定法第一法來測定提取物的含水量 （%），得浸膏得率（%）=m×（1-含水量%）÷M×100%，結(jié)果見表3。

2.2 蔓荊子黃素測定

2.2.1 色譜條件［2］Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液 （60∶40）；柱溫30℃；體積流量1.0mL/min；進樣量10μL；檢測波長258 nm；理論塔板數(shù)按蔓荊子黃素計算，不得低于2 000。色譜圖見圖1。

圖1 對照品和蔓荊子提取物的HPLC色譜圖

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取 “2.1”項下的蔓荊子提取物，用甲醇溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，即得供試品溶液。經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱定蔓荊子黃素對照品，置于50mL量瓶中，用甲醇溶解，定容，搖勻，即得對照品溶液，每1mL含蔓荊子黃素30μg。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取蔓荊子黃素對照品溶液4、8、16、20、24、32μL，依次注入液相色譜儀中，以峰面積為縱坐標 （Y），對照品進樣量為橫坐標 （X）繪制標準曲線，得曲線方程Y=55.986X-0.169 3（r2=0.999 8，n=6）。結(jié)果表明，蔓荊子黃素在0.12～0.96μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取蔓荊子黃素對照品溶液10μL，“2.2.1”項條件下重復(fù)進樣6次，記錄峰面積值。結(jié)果測得RSD為1.31%，說明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，“2.2.1”項條件下于0、2、4、8、12、24 h進樣10μL，記錄峰面積值。結(jié)果測得RSD為0.27%，說明該溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取3號蔓荊子提取物，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份， “2.2.1”項條件下測定。結(jié)果測得RSD為0.87%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗 精密稱取3號蔓荊子提取物，并精密加入蔓荊子黃素對照品，按 “2.2.2”項下制備供試品溶液，“2.2.1”項條件下進行測定。結(jié)果測得蔓荊子黃素的平均加樣回收率為102.23%，RSD為1.44%，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.3 蔓荊子總黃酮的測定［11-12］

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品11.24 mg，置于50 mL量瓶中，用70%乙醇溶解，定容，搖勻，即得對照品溶液，每1 mL含無水蘆丁0.224 8 mg。

2.3.2 測定方法 精密吸取 “2.1”項下蔓荊子提取物，用70%乙醇溶解，依次加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL（放置6min）、10%硝酸鋁溶液1mL（放置6min）、4%NaOH溶液10mL，搖勻。之后加入70%乙醇，定容至25 mL量瓶中，放置20 min，采用紫外分光光度法于504 nm處測定吸光度。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.3.1”項下對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，按 “2.3.2”項下方法測定，以吸光度 （A）為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程A=0.009 5C-0.032 1（r2=0.999 2）。結(jié)果表明，蘆丁在8.992～53.952 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取蘆丁對照品溶液，按“2.3.2”項下方法操作，連續(xù)測定6次，記錄吸收值。結(jié)果測得RSD為2.17%，說明精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，按“2.3.2”項下方法操作，分別在0、15、30、60、90、120 min測定，記錄吸收值。結(jié)果測得RSD為0.73%，說明該溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取3號蔓荊子提取物，按 “2.3.2”項下方法制備供試品6份進行測定，記錄吸收值。結(jié)果測得RSD為1.40%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收試驗 精密稱取3號蔓荊子提取物，加入蘆丁對照品，按 “2.3.2”項下方法制備供試品6份進行測定，計算回收率。結(jié)果測得平均回收率為97.88%，在95%～105%范圍內(nèi)，RSD為0.75%。

2.4 正交試驗

2.4.1 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分數(shù) （A）、乙醇用量 （B）、粉碎度 （C）、提取次數(shù)（D）為考查因素，每個因素選擇3個水平，設(shè)定因素水平表，見表2。

表2 正交因素水平

2.4.2 正交試驗結(jié)果 按照L9（34）正交設(shè)計表的條件進行試驗，分別測定浸膏得率、提取物總黃酮含有量和蔓荊子黃素的含有量，計算提取率，并進行綜合加權(quán)評分。由于單葉蔓荊子的主要黃酮類化合物為蔓荊子黃素，且其含有量為 《中國藥典》2010年版規(guī)定的蔓荊子質(zhì)量評價指標，故在正交試驗結(jié)果的總體評價中，以蔓荊子黃素的提取率為主，權(quán)重系數(shù)為0.7；總黃酮提取率和浸膏得率為輔，權(quán)重系數(shù)分別為0.2和0.1，以綜合值進行統(tǒng)計分析，綜合評分值M=（0.1X/17.82+0.7Y/0.163+0.2Z/3.205）×100，結(jié)果見表3～4。

表3 正交試驗方案及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

分析表明，根據(jù)極差R的大小，可以判斷各因素對試驗結(jié)果的影響。由表3可以看出，R3＞R4＞R2＞R1，所以各因素對試驗指標影響的主次順序為C＞D＞B＞A，即藥材的粉碎度影響最大，其次為提取次數(shù)和溶劑用量，而乙醇體積分數(shù)影響最小。表4方差分析發(fā)現(xiàn)，C（粉碎度）對試驗結(jié)果有顯著性影響 （P＜0.05），而B（乙醇用量）和D（提取次數(shù)）則無顯著性影響 （P＞0.05）。同時在比較F值大小時，可以判斷各因素對試驗結(jié)果影響的主次順序為C＞D＞B，與直觀分析結(jié)果相同。綜上所述，確定A1B1C3D3為最適宜的提取工藝，即藥材經(jīng)粉碎機粉碎，過40目篩，加8倍量50%的乙醇，提取3次，每次1 h。

2.5 優(yōu)選工藝驗證 為了保證提取工藝的重復(fù)性和可行性，對優(yōu)選的方案A1B1C3D3進行驗證試驗，結(jié)果見表5。由表可知，該工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性好。

表5 驗證試驗

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 蔓荊子的主要活性成分為黃酮類化合物，多以苷元的形式存在，脂溶性較強［13-14］。該類成分以蔓荊子黃素為主，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿等溶劑，其中乙醇是中藥大生產(chǎn)提取常用的溶媒，易于回收，價格便宜，因此選擇乙醇為提取溶劑。

3.2 單次提取時間的選擇 通過比較單次提取時間（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 h）對蔓荊子浸膏得率、總黃酮含有量和蔓荊子黃素含有量的影響，發(fā)現(xiàn)提取時間越長，其得率和含有量越高，而且在1.0 h、1.5 h、2.0 h內(nèi)無顯著性差異。綜合考慮提取效率和資源節(jié)約，故確定單次提取時間為1.0 h。

3.3 測定波長的選擇 取供試品溶液，以70%乙醇為空白對照，加入顯色劑，按紫外分光光度法在450～800 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果供試品溶液在504 nm處產(chǎn)生最大吸收，故選擇504 nm為測定波長。

3.4 考察指標選擇 蔓荊子疏散風熱、清利頭目的功效不是某個單一成分作用的結(jié)果，而是由多種物質(zhì)共同作用所致，故應(yīng)綜合考慮浸膏得率、總黃酮、蔓荊子黃素等多個考察指標。由于蔓荊子黃素是 《中國藥典》規(guī)定的檢測指標，也是蔓荊子藥效的主要物質(zhì)之一，故在分配權(quán)重系數(shù)時，蔓荊子黃素定為0.7，總黃酮定為0.2，浸膏得率定為0.1，這種多指標綜合加權(quán)評分法可避免單一評價的片面性，使分析指標更全面，同時對關(guān)鍵影響因素又給予相應(yīng)側(cè)重，使分析結(jié)果更為客觀。雖然有效成分是中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，但由于中藥成分復(fù)雜多樣，故應(yīng)在成分考察的基礎(chǔ)上，對相關(guān)動物模型進行深入研究，結(jié)合反映藥效的指標來優(yōu)化提取工藝，為蔓荊子提取物的生產(chǎn)工藝提供可靠的參考依據(jù)。

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R284.2

：B

：1001-1528（2015）06-1363-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.048

2014-04-12

江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計劃課題資助項目 （2013Z003）；江西中醫(yī)藥大學道地藥材及特色中藥資源研究專項資助項目（ZX1016）

張金蓮 （1969—），女，碩士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥學教學研究。Tel：（0791）87118995，E-mail：jxjzzjl@ 163.com