響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取廣豆根中總黃酮工藝

蘭艷素， 李長江， 亓昭鵬， 張 萍， 汪 奎

（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽黃山245041）

響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取廣豆根中總黃酮工藝

蘭艷素， 李長江， 亓昭鵬， 張 萍， 汪 奎

（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽黃山245041）

目的利用響應(yīng)面分析法對廣豆根總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法通過單因素試驗，考察微波功率、液料比以及提取時間對廣豆根總黃酮得率的影響，并進(jìn)行Box-Behnken實驗設(shè)計，建立二次回歸方程，應(yīng)用響應(yīng)面分析來確定微波輔助提取總黃酮的最佳工藝條件。結(jié)果最佳工藝條件為微波功率560W，液料比25∶1（mL/g），提取時間3min。在此條件下，總黃酮得率為9.454 mg/g，與預(yù)測值吻合。結(jié)論該方法簡便、快速、可預(yù)測性較好。

廣豆根；總黃酮；微波輔助提取；響應(yīng)面法

廣豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根及根莖，也叫做山豆根、小黃連等［1］，一般生長于石灰?guī)r石縫中，在廣西分布較多。藥理活性實驗顯示，該植物具有消炎、抗氧化以及改善血管滲透性等多種活性［2-3］，常被用于治療咽喉腫痛、心律失常和黃疸等病癥，是我國傳統(tǒng)的一味中藥［4］。廣豆根中的生物堿含量較高，另外還富含黃酮類成分，其中以二氫黃酮較為常見［5］。在前期工作中，課題組已對廣豆根的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并從中分離得到10個黃酮類化合物［6］以及一個新的異黃酮類化合物［7］。

提取中藥有效成分的手段比較多，最常用的是乙醇回流提取法［8］，但該方法在實際操作過程中既耗時又費力。微波提取作為一種現(xiàn)代化技術(shù)，具有易操作、省時、省能等優(yōu)點［9-10］，而且有效成分的提取率較高，所以已被應(yīng)用于黃酮等有效成分的提?。?1］。

但到目前為止，采用微波法輔助提取廣豆根中總黃酮的研究尚未見報道。本實驗將微波輔助提取技術(shù)應(yīng)用于廣豆根總黃酮的提取，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化其工藝條件，為該植物資源的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試劑

UV-2600型紫外可見分光光度計 （日本島津公司）；MCR-3S型常壓微波合成萃取儀 （鞏義市予華儀器有限公司）；TG165高速離心機(jī) （長沙平凡儀器儀表有限公司）；電子分析天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；GZX-9030 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FW100型高速萬能粉碎機(jī) （天津市泰斯特儀器有限公司）。

廣豆根采于安徽嶺南自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院方建新老師鑒定為豆科植物越南槐的干燥根及根莖；蘆丁對照品購于中國藥品生物制品檢定所 （批號10080-200707）。所用試劑均為分析純 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水 （自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 原料預(yù)處理 廣豆根藥材用清水洗凈，陰涼處自然風(fēng)干后放入干燥箱內(nèi)，60℃下干燥24 h，粉碎備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 采用測定總黃酮的常規(guī)方法，并參考文獻(xiàn) ［12］測定提取液的吸光度。以吸光度值 （Y）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度 （X）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得線性回歸方程Y=10.107X+0.045 9，r2=0.999 7，表明線性關(guān)系良好，滿足實驗要求。

2.3 樣品溶液的制備與總黃酮測定 將稱好的廣豆根樣品放入100mL圓底燒瓶中，并置于微波爐爐腔正中間，接上冷凝裝置，在單因素以及Box-Behnken實驗方案的條件下進(jìn)行微波輔助提取，同時通入冷凝水以盡可能避免乙醇揮發(fā)引起的誤差。提取液冷卻后，離心機(jī)低速離心10 min，用移液管移取7 mL上層清液于50 mL量瓶中，定容，即得待測液。再移取其中5.0 mL于10 mL量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液，乙醇定容至刻度線，搖勻，以不含蘆丁的溶液為空白溶液進(jìn)行調(diào)零，在510 nm處測定溶液吸光度值，每個實驗點做3次平行實驗，取平均值。

2.4 總黃酮提取率的計算 樣品中總黃酮含有量以蘆丁計，計算公式如下。注：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的總黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL）；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積 （mL）；m為樣品質(zhì)量 （g）

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取同一質(zhì)量濃度蘆丁對照品溶液1.0 mL，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色后，于510 nm處測定溶液吸光度，做5次平行試驗，結(jié)果RSD為1.34%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取待測溶液5.0 mL，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色后，每隔15 min測定一次溶液的吸光度，結(jié)果RSD為1.42%（n=8），表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗 精密稱取5份廣豆根粗粉藥材，每份1.0 g，按照 “2.3”項下方法制備待測液，顯色后于510 nm處測定溶液吸光度，結(jié)果RSD為0.98%，說明重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 精密吸取6份廣豆根提取液，總黃酮含有量均為0.756 mg/mL，分別加入等量的對照品，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色后，于510 nm處測定溶液吸光度，結(jié)果平均回收率為101.19%，RSD為1.78%。

2.6 單因素試驗

2.6.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對廣豆根總黃酮得率的影響 液料比均為20∶1（mL/g），分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，浸泡30m in后置于微波爐爐腔中，微波功率設(shè)置為560W，50℃條件下提取3 min，所得提取液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定吸光度值，結(jié)果計算出的總黃酮得率分別為9.34、9.51、9.62、9.79、9.57 mg/g?？梢娖渌麠l件不變時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，黃酮得率先增加后減少，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為80%時得率最高。因此，本實驗乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇為80%。

2.6.2 微波功率對廣豆根總黃酮得率的影響 液料比均為20∶1（mL/g），80%乙醇浸泡30min后置于微波爐中，設(shè)置提取溫度為50℃，分別在320、400、480、560和640 W微波功率條件下提取3 min，所得提取液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定溶液吸光度值，結(jié)果計算出的總黃酮得率分別為9.89、10.26、10.36、10.56、10.39 mg/g?？梢娢⒉üβ瘦^低時，提取所得的總黃酮量也較少，當(dāng)功率為560 W時得率最高，但隨著功率進(jìn)一步升高，得率卻有所下降，可能是因為功率過高時會破壞化合物結(jié)構(gòu)。因此，本實驗微波功率選擇為560W。

2.6.3 液料比對廣豆根總黃酮得率的影響 稱取6份廣豆根藥材粗粉，每份1.0 g，分別用10、15、20、25和30 mL 80%乙醇浸泡30min后，設(shè)置提取溫度為50℃，560W微波功率條件下提取3 min，提取液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定溶液吸光度值，結(jié)果計算出的總黃酮得率分別為9.31、9.68、10.02、10.22、10.20、10.19 mg/g?？梢娨毫媳仍?0∶1～25∶1之間變化時，黃酮得率也隨之迅速增加，并在25∶1處得率最高，但液料比進(jìn)一步加大后，得率卻無明顯變化。因此，本實驗液料比選擇為25∶1。

2.6.4 提取時間對廣豆根總黃酮得率的影響 各因素均采用優(yōu)化后得到的最佳條件，即用25 mL 80%乙醇浸泡廣豆根藥材30 min后，在560 W微波功率條件下分別提取1、2、3、4和5 min，提取液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定溶液吸光度值，結(jié)果計算出的總黃酮得率分別為8.70、8.87、9.31、9.16、9.07 mg/g。表明隨著提取時間增加，總黃酮得率迅速上升，在3 min時得率最高，但若提取時間過長，得率反而會降低。因此，本實驗微波提取時間選擇為3 min。

2.7 Box-Behnken實驗設(shè)計水平及結(jié)果 通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)，在設(shè)定范圍內(nèi)，有3個考察因素 （微波功率、液料比和提取時間）對總黃酮得率影響較大，而乙醇體積分?jǐn)?shù)則影響較小。因此，本實驗選擇微波功率、液料比和提取時間為自變量，總黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken實驗設(shè)計，因素水平表見表1。

表1 因素水平編碼

稱取廣豆根藥材，每份1 g，在Box-Behnken實驗方案條件下提取，提取液經(jīng)離心處理后測定吸光值，計算出總黃酮得率，結(jié)果見表2。

表2 實驗設(shè)計與結(jié)果

表2數(shù)據(jù)經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件回歸分析，并進(jìn)行擬合，得到以上3個實驗因素對總黃酮得率影響的回歸模型方程：Y=9.34-0.256A-0.159B-0.09C-0.05AB-0.533AC+0.098BC-0.7A2-0.375B2-0.538C2，方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析結(jié)果

由表3可知，以上3個實驗因素的P值均＜0.001，表明它們對總黃酮得率均有非常顯著的影響。其中，微波功率影響最大，而提取時間影響則相對最小。另外在多次項中，微波功率和液料比之間的交互作用P值＞0.05，說明對得率影響不明顯，除此之外，液料比和提取時間的交互作用、微波功率和提取時間的交互作用以及平方項對其影響均非常顯著。

實驗所得的回歸模型P值＜0.000 1，說明實驗因素對響應(yīng)值的影響有極高的顯著性。模型方程的相關(guān)系數(shù)r2= 0.99，且方程失擬項P值為0.252 8，表明該方程與真實實驗點的擬合性較好，實驗方法確實可信。

2.8 響應(yīng)面分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件，以實驗因素為橫坐標(biāo)，總黃酮得率為縱坐標(biāo)，繪制交互作用的3D響應(yīng)曲面，見圖1～3。

圖1 液料比與微波功率交互影響黃酮得率的響應(yīng)面圖

由圖1可知，液料比與微波功率交互作用的響應(yīng)曲面較為平滑，隨著微波功率的升高以及液料比的增大，總黃酮得率先增加后減少，但變化程度不明顯。當(dāng)微波功率為560W，液料比為25∶1（mL/g）時得率最高，可達(dá)9.379 mg/g。

圖2 提取時間與液料比交互影響黃酮得率的響應(yīng)面圖

圖3 提取時間與微波功率交互影響黃酮得率的響應(yīng)面圖

由圖2可知，提取時間與液料比交互作用的響應(yīng)曲面開口往下，隨著液料比的增大以及提取時間的延長，總黃酮得率先緩慢提高，當(dāng)達(dá)到最大值后，開始緩慢降低。說明液料比和提取時間的變化對得率有一定影響，并且在合適條件下，可以使其達(dá)到最大值。

由圖3可知，提取時間與微波功率交互作用的響應(yīng)曲面比較陡峭，表明兩者對總黃酮得率影響非常顯著。當(dāng)提取功率較小，提取時間較短時，得率較低，之后隨著功率和時間的變化而迅速增加，在微波功率560 W以及提取時間3 m in處，響應(yīng)值出現(xiàn)最高點，即得率最高。

2.9 廣豆根總黃酮提取工藝的確定與驗證 通過Design Expert軟件對回歸方程進(jìn)行求解，可以得到微波輔助法提取總黃酮的理論最優(yōu)條件是：微波功率546.5 W，液料比24.0∶1（mL/g），提取時間3.0 min，預(yù)測得率為9.379 mg/g。

稱取5份廣豆根粗粉，在優(yōu)化的工藝條件下提取，提取液測定吸光度。結(jié)果計算出總黃酮的平均得率為9.454 mg/g，相對誤差為0.8%，與預(yù)測值基本相符，說明該模型方程可靠。

3 討論

為考察不同提取方法對提取效果的影響，本實驗分別采用微波法和回流提取法輔助提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法下的廣豆根總黃酮得率相當(dāng)，但前者所需時間明顯縮短，并且后者所需溫度明顯高于前者，黃酮類成分的結(jié)構(gòu)可能會被破壞。因此，本實驗選擇微波法進(jìn)行提取。

通過單因素試驗來確定主要影響因素以及因素最佳水平，并設(shè)計Box-Behnken實驗方案，利用響應(yīng)面法對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果優(yōu)化得到的最佳提取工藝為：微波功率560W，液料比25∶1（mL/g），提取時間3min，在該條件下總黃酮得率為9.454mg/g。

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R284.2

：B

：1001-1528（2015）06-1360-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.047

2014-04-17

安徽省高校省級優(yōu)秀青年人才重點項目基金 （2013SQRL088ZD）；安徽省高校省級自然科學(xué)研究項目 （KJ2011B168）；黃山學(xué)院自然科學(xué)基金項目 （2011xkj017）；黃山學(xué)院大學(xué)生科學(xué)研究項目 （2012xdkj074）

蘭艷素 （1985—），女，碩士，助教，研究方向為天然有機(jī)化學(xué)。Tel：13685595775，E-mail：ls7536858@163.com