正交試驗(yàn)優(yōu)選白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ提取工藝

梁志遠(yuǎn)， 甘秀海， 吳 坤， 張君勇， 練小衛(wèi)

（1.貴州師范學(xué)院藥用植物研究所，貴州貴陽550018；2.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550018）

正交試驗(yàn)優(yōu)選白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ提取工藝

梁志遠(yuǎn)1，2， 甘秀海1，2， 吳 坤2， 張君勇2， 練小衛(wèi)2

（1.貴州師范學(xué)院藥用植物研究所，貴州貴陽550018；2.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550018）

目的優(yōu)選白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ提取工藝。方法以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取次數(shù)為考察因素，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的提取工藝。結(jié)果最佳提取工藝條件為85%乙醇，料液比1∶12，在50℃下提取2次，每次30 min。結(jié)論該提取工藝操作簡單、方便、安全，穩(wěn)定性好，為白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

白術(shù)；白術(shù)內(nèi)酯；超聲波；正交試驗(yàn)；提取工藝

白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atracttylodesmacrocephala koidz的干燥根莖，性味甘、苦、溫，具有健脾、益氣、燥濕利水、止汗安胎等功效［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白術(shù)還具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)胃腸道功能和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收的作用。白術(shù)主要產(chǎn)于浙江、安徽、湖南、湖北、江西、福建等地，以浙江磐安、鄞縣、新昌地區(qū)產(chǎn)量最大，于潛所產(chǎn)品質(zhì)最佳［2］。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ是白術(shù)的有效成分，也是白術(shù)藥材質(zhì)量控制的主要指標(biāo)［3-5］。由于白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ含有量較低，性質(zhì)又不太穩(wěn)定，如何對(duì)其進(jìn)行提取，一直受到人們的關(guān)注。目前用于白術(shù)內(nèi)酯的提取方法有：有機(jī)溶劑冷或熱浸提法、滲漉法、索氏提取法、超聲波提取法，水蒸氣蒸餾法和超臨界 CO2萃取法等［6-8］，溶劑常用甲醇［9-11］。

超聲波技術(shù)近年來發(fā)展非常迅速，具有省時(shí)、節(jié)能、高效等特點(diǎn)。該法是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌等，造成植物組織細(xì)胞壁的破裂，增加溶劑滲入細(xì)胞組織，加快細(xì)胞內(nèi)含物的釋放，從而提高浸出率，縮短提取時(shí)間，同時(shí)可避免高溫對(duì)提出成分的影響，被廣泛用于中藥有效成分的提取［12］。本研究以乙醇為溶媒，采用超聲波輔助提取，考察了料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取次數(shù)因素對(duì)提取率的影響。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的提取工藝，以期為白術(shù)內(nèi)酯的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（美國惠普公司）；BSA124S型電子天平 （北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有限公司）；KQ3200B型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；XFB-200BC微型萬能粉碎機(jī) （長沙市雨花區(qū)中誠制藥機(jī)械廠）。

1.2 材料 藥材白術(shù)購于貴陽藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院席先蓉教授鑒定為白術(shù)Atractylodesmacroeephala Koidz的根莖。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ對(duì)照品購于貴州省迪大科技有限責(zé)任公司（批號(hào)分別為GZ73069-12-3和GZ73030-71-4，純度均大于99%）；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，乙醇為食用級(jí)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ對(duì)照品8.0 mg和10.0 mg，用甲醇溶解，置50 mL量瓶中并定容，制成白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ質(zhì)量濃度分別為160和200 μg/mL的混合對(duì)照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取過40目的白術(shù)粉末（50℃衡重4 h）0.5 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入95%乙醇20mL，在40℃下超聲提取30min，提取液過濾，減壓除盡乙醇和水，甲醇溶解，取上清液過0.45μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 ZORBAXSB.C18色譜柱（150 mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水 （65∶35）；體積流量1.0m L/m in；檢測(cè)波長220 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。色譜圖見圖1。

圖1 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ對(duì)照品 （A）和供試品 （B）HPLC色譜圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和III混合對(duì)照品貯備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得白術(shù)內(nèi)酯I和III質(zhì)量濃度分別為16、32、64、96、128、160μg/mL和20、40、80、120、160、200μg/mL的對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下進(jìn)行分析。以白術(shù)內(nèi)酯對(duì)照品質(zhì)量濃度 （μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并進(jìn)行線性回歸，求得兩種內(nèi)酯回歸方程，白術(shù)內(nèi)酯 I：Y= 40.94X+74.431，r=0.999 7；白術(shù)內(nèi)酯 III：Y= 26.078X+49.741，r=0.999 9。結(jié)果表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ分別在16～160μg/mL和20～200μg/mL范圍內(nèi)峰面積積分值與質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取 “2.1.4”項(xiàng)下白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ度分別為 64、80μg/m L混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的RSD分別為0.77%和0.55%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，按 “2.1.3”項(xiàng)下測(cè)定，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的RSD分別為1.63%和1.68%。表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。取一供試品溶液按 “2.1.3”項(xiàng)下測(cè)定，置于冰箱冷藏24 h后再測(cè)定，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的RSD分別為1.72%和2.80%。表明供試品溶液置冰箱冷藏在24 h內(nèi)仍能保持穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材5份，每份0.5 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按 “2.1.3”項(xiàng)下測(cè)定。結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的RSD分別為1.36%和1.40%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的白術(shù)藥材6份，每份0.25 g，3份分別精密加入白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ對(duì)照品貯備液2 mL（即白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ各加320μg和400 μg），3份分別精密加入白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ對(duì)照品貯備液3 mL（即白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ各加 480μg和 600μg），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.1.3”項(xiàng)下測(cè)定，結(jié)果見表1，結(jié)果表明方法的回收率較好。

表1 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的加樣回收率

2.2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ最佳提取工藝的優(yōu)選

2.2.1 超聲提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以提取液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察單因素對(duì)提取率影響。精密稱取過40目的白術(shù)粉末 （50℃衡重4 h）0.5 g，在前期研究基礎(chǔ)上，分別研究料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 4個(gè)水平，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、75%、85%、95%4個(gè)水平，提取溫度30、40、50、60℃4個(gè)水平，提取次數(shù)1、2、3次3個(gè)水平的單因素試驗(yàn)條件下，測(cè)定提取液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的含有量，得出各因素的最佳范圍。

單因素試驗(yàn)顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的提取率隨料液比的增大有增高的趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)到1∶14時(shí)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的提取率略有增加，但白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的反而降低；隨提取溫度的升高白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的提取率也有增大的趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度達(dá)到60℃時(shí)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的提取率都降低。在考察超聲時(shí)間對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ提取率的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)超聲30 m in已基本提取完全。

2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取次數(shù)四個(gè)因素的3個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)表安排實(shí)驗(yàn)，因素與水平見表2。

表2 因素水平

2.2.3 正交試驗(yàn)方法與結(jié)果 精密稱取過40目的白術(shù)粉末 （50℃衡重4 h）9份，每份0.5 g，置100mL具塞錐形瓶中，按 “2.2.2”項(xiàng)下的正交試驗(yàn)方法超聲提取，提取液過濾，減壓除盡乙醇和水，殘余物用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶并定容，0.45μm濾膜過濾，得供試品溶液1～9號(hào)，然后按 “2.1.3”項(xiàng)下測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的含有量，并進(jìn)行極差和方差分析。結(jié)果見表3～5。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果 （n=2）

表4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表5 方差分析

從表4極差R值看出，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ都是RB＞RC＞RA＞RD，即影響因素主次順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比＞提取次數(shù)。從表4方差分析結(jié)果表明，對(duì)于白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的提?。阂掖俭w積分?jǐn)?shù)影響顯著，料液比和提取溫度有一定影響，提取次數(shù)影響甚微；對(duì)于白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的提取：乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度影響非常顯著，料液比有一定影響，提取次數(shù)影響甚微，即正交試驗(yàn)的極差分析和方差分析都顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)兩種內(nèi)酯的提取結(jié)果有顯著影響，為影響提取率的主要因素，提取溫度和料液比為次要因素。綜合考慮極差和方差分析結(jié)果，篩選出超聲波輔助乙醇提取白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的最佳工藝條件A3B2C3D2，即料液比1∶12、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%、提取溫度50℃、提取2次，每次30 min。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 精密稱取過40目的白術(shù)粉末 （50℃衡重4 h）6份，每份0.5 g，3份按優(yōu)選出方法制備供試品溶液，3份按文獻(xiàn) ［13］的方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下測(cè)定，優(yōu)選方法的結(jié)果為白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的平均含有量分別為0.75 mg/g和1.41mg/g，文獻(xiàn)方法的平均含有量分別為0.77mg/g和1.40mg/g。本研究又將量擴(kuò)大到5倍，即取2.5 g白術(shù)粉末，按上述方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選方法的結(jié)果為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的平均值分別為0.71mg/g和1.38 mg/g，文獻(xiàn)方法的平均值分別為0.75 mg/g和1.39 mg/g，表明兩種方法提取效率相當(dāng)。

3 討論與結(jié)論

在文獻(xiàn) ［9］的基礎(chǔ)上，本研究考察了乙腈-水、乙腈-0.2%乙酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水等不同流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)能獲得分離度較好的色譜峰；進(jìn)而探究了甲醇與水80∶20、70∶30、65∶35、60∶40，結(jié)果在甲醇與水65∶35的比列下，供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ峰間的分離度大于4，并能與雜質(zhì)峰達(dá)到較好的基線分離，保留時(shí)間也較適合。

通過考察發(fā)現(xiàn)提取溫度不宜過高，50℃比較合適，溫度高于50℃提取率反而會(huì)降低?？赡苁莾煞N白術(shù)內(nèi)酯都不夠穩(wěn)定所致，因?yàn)榘仔g(shù)內(nèi)酯Ⅲ分子有個(gè)羥基，易發(fā)生分子內(nèi)脫水生成白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，另白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ與白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可進(jìn)行分子間脫水，生成雙白術(shù)內(nèi)酯［14-15］。

通過考察發(fā)現(xiàn)提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的降低而降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%比較合適?？赡苁沁@兩種內(nèi)酯極性都不大，降低乙醇體積分?jǐn)?shù)即增加溶媒的極性，導(dǎo)致它們?cè)谄渲械娜芙舛冉档?。研究中還發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的降低，極性雜質(zhì)的溶出量增多，最后用甲醇定容時(shí)不溶物也隨之增加，干擾測(cè)定。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)相對(duì)高些，有利提高白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的提出率和純度。

通過考察發(fā)現(xiàn)提取率隨料液比的增大有增高的趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)到1∶14時(shí)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的提取率略有增加，但白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的反而降低。可能是料液比增加，相應(yīng)水量增加，減壓除去乙醇和水的時(shí)間延長，導(dǎo)致白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ發(fā)生分子內(nèi)脫水轉(zhuǎn)變成白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。因此，料液比不宜太高。

本研究的方法與文獻(xiàn) ［13］的相比，最大的不同是用食用級(jí)乙醇代替文獻(xiàn)中的甲醇作溶媒，雖然在提取時(shí)間、提取次數(shù)和溶劑用量方面也隨著改變，但安全性提高了。從植物中提取有效成分，乙醇和甲醇都是人們常用的溶媒，乙醇的極性比甲醇稍弱，往往通過加適量的水來增加其極性，甲醇的沸點(diǎn)相對(duì)較低，除去方便。因此，在用量不大時(shí)人們更喜歡使用甲醇。但甲醇毒性較大，不宜工業(yè)化生產(chǎn)。

本研究采用超聲波輔助提取法，其優(yōu)點(diǎn)之一為高效、快速，可避免白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ長時(shí)間處于較高溫度下導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。另外，采用食用級(jí)乙醇作溶媒，所篩選出超聲波輔助乙醇提取白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的最佳工藝，方法合理可行，結(jié)果穩(wěn)定，提取率高；所需設(shè)備簡單，操作方便安全；適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

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R284.2

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：1001-1528（2015）06-1356-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.046

2014-03-18

貴陽市烏當(dāng)區(qū)科技局基金資助項(xiàng)目 （烏科字 ［2012］58號(hào)）

梁志遠(yuǎn) （1959—），女，教授，主要從事有機(jī)化學(xué)教學(xué)和藥用植物成分研究工作。Tel：（0851）85816647，E-mail：gzwh24000@ sina.com