補(bǔ)腎壯陽類中成藥中非法添加物PDE5抑制劑的分離鑒定

黃國(guó)棟， 黃艷婷， 陳 林， 雷 毅*， 張 榮*

（1.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510180）

［成分分析］

補(bǔ)腎壯陽類中成藥中非法添加物PDE5抑制劑的分離鑒定

黃國(guó)棟1， 黃艷婷2， 陳 林1， 雷 毅2*， 張 榮1*

（1.廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510180）

目的研究補(bǔ)腎壯陽類藥物中非法添加物的提純與結(jié)構(gòu)鑒定，為國(guó)內(nèi)研究補(bǔ)腎壯陽中成藥及保健品中非法添加物提供技術(shù)支持和相關(guān)譜圖數(shù)據(jù)。方法使用薄層色譜、柱色譜、高效液相色譜對(duì)非法添加物進(jìn)行分離和提純；使用核磁共振、質(zhì)譜確定非法添加物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果提純得到黃色針狀結(jié)晶，純度為97%，化學(xué)結(jié)構(gòu)確定為5-﹛5-［4-（2-羥乙基）哌嗪磺酰］-2-正丙氧基苯基﹜-1-甲基-3-正丙基-1H-吡啶并 ［4，3-d］嘧啶-7（6H）-硫酮。結(jié)論

補(bǔ)腎壯陽；非法添加物；PDE5抑制劑；分離鑒定；5-﹛5-［4-（2-羥乙基）哌嗪磺酰］-2-正丙氧基苯基﹜-1-甲基-3-正丙基-1H-吡啶并 ［4，3-d］嘧啶-7（6H）-硫酮

PDE5（磷酸二酯酶5型）抑制劑是一種治療男性陽痿和勃起功能障礙的藥物［1］。目前，在美國(guó)FDA批準(zhǔn)的PDE5抑制劑藥物僅有西地那非（偉哥?）、伐地那非 （艾力達(dá)?）和他達(dá)拉非 （希愛力?）3種，但對(duì)心血管疾病和糖尿病患者有嚴(yán)重不良反應(yīng)［2-3］，因此必須在醫(yī)生指導(dǎo)下使用。由于西地那非的特殊用途和高額利潤(rùn)，一些不法分子在壯陽類中成藥和保健食品中非法添加其原料以牟取暴利［4］。近年來，隨著國(guó)家查處力度的不斷加強(qiáng)，不法分子通過非法添加西地那非同系物的隱蔽方式來逃避監(jiān)管。自2003年至2013年的10年間，有50多種PDE5抑制劑衍生物被陸續(xù)報(bào)道［5］，如西地那非的新衍生物豪莫西地那非［6］、紅地那非、羥基豪莫西地那非［7］、羥基紅地那非［8］、那紅地那非［9］、硫代西地那非、硫代豪莫西地那非、偽紅 地 那 非［10］、氨 基 他 達(dá) 拉 非［11］、Benzamidenafil［12］等，這類未經(jīng)安全檢驗(yàn)的非法添加物將會(huì)對(duì)消費(fèi)者的身體健康帶來極大的威脅［13-16］。本實(shí)驗(yàn)采用色譜方法從樣品勃爾特膠囊中分離得到一種非法添加的新西地那非衍生物，之后應(yīng)用核磁和質(zhì)譜，確定該成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)為5-﹛5-［4-（2-羥乙基）哌嗪磺酰］-2-正丙氧基苯基﹜-1-甲基-3-正丙基-1H-吡啶并［4，3-d］嘧啶-7（6H）-硫酮，為首次報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥和試劑 勃爾特膠囊 （0.4g×16粒），批號(hào)110902，購(gòu)于互聯(lián)網(wǎng)。甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、正己烷、氨水均為分析純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硅膠 （300目，青島海洋化工有限公司）；蒸餾水 （自制）。

1.2 儀器 LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；Advance DMX500全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀（500 MHz，瑞士Bruker公司）；液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 柱色譜分離 取1粒膠囊內(nèi)容物，約0.3 g，置于20 mL具塞錐形瓶中，甲醇10 mL溶解，超聲提取15 min，冷卻至室溫，0.45μm微孔濾膜濾過，即得濾液。往濾液中加入0.9 g硅膠，攪拌均勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮蒸干，即得供試品粉末拌樣硅膠，備用。取300目硅膠50 g濕法裝柱，然后干法上拌樣硅膠，以乙醇-丙酮-正己烷-氨水 （5∶20∶60∶1）為洗脫劑淋洗，洗脫體積流量 1 mL/min。收集前2條色帶的洗脫溶液，每5 mL收集1瓶，共70瓶，分別點(diǎn)于硅膠GF254（10 cm× 10 cm）上，乙醇-丙酮-正己烷-氨水 （5∶20∶60∶1）展開，在紫外光波長(zhǎng)254 nm處觀察熒光情況。之后將Rf值相同的洗脫液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮蒸干，置通風(fēng)櫥中靜置結(jié)晶。

2.2 液相色譜條件 采用YMC-C18（250 mm× 4.6 mm，5μm）色譜柱；二極管陣列檢測(cè)器，掃描波長(zhǎng)范圍200～400 nm；柱溫35℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10μL；流動(dòng)相A為磷酸三乙胺溶液 （取三乙胺7 mL，加水稀釋至1 000 m L，再用磷酸調(diào)pH至2.8，即得）-甲醇-乙腈 （60∶20∶20），流動(dòng)相B為磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈（8∶46∶46），梯度洗脫順序參照 《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件 （2009030）》，見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution

2.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化源 （ESI）正離子檢測(cè)模式，碰撞電壓46 V，掃描方式為全掃描一級(jí)質(zhì)譜、選擇離子全掃描二級(jí)質(zhì)譜。

2.4 核磁共振光譜檢測(cè) 氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）為溶劑，四甲基硅烷 （TMS）為內(nèi)標(biāo)。

3 結(jié)果和討論

3.1 高效液相色譜研究 高效液相色譜結(jié)果見圖1。由圖可知，在保留時(shí)間tR=30.129 min處，主成分按峰面積歸一化法計(jì)算，測(cè)得純度為97.6%，色譜純度指數(shù)為0.971，表明能達(dá)到核磁共振的分析純度要求。

圖1 樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of sample

3.2 質(zhì)譜研究 通過柱色譜分離得到的晶體純度高達(dá)97%，并應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)得到該晶體的質(zhì)譜圖，見圖2。

圖2 樣品MS譜Fig.2 M ass spectrum of sam p le

樣品的［M+H］+峰m/z為535.3，二級(jí)質(zhì)譜主要裂解碎片m/z分別為517.3、359.3、341.4、315.2、 299.0、271.1、129.3、 112.3、 99.2、84.2和58.3。其中，m/z 299.0和99.2是硫代西地那非類物質(zhì)的特征碎片離子峰［17］，推測(cè)樣品是硫代西地那非類，結(jié)構(gòu)見圖3。另外，其分子質(zhì)量與樣品分子質(zhì)量相差44，推測(cè)樣品比硫代西地那非多2個(gè)CH2和1個(gè)氧原子。樣品質(zhì)譜圖中出現(xiàn)517.3（M-18）峰，為分子脫去1個(gè)水分子所致，推測(cè)樣品分子中含有羥基。硫代西地那非以砜基團(tuán)O=S=O為中心發(fā)生異裂，產(chǎn)生m/z 327的離子峰，然后苯環(huán)上的乙氧基脫去C2H4，形成m/z299的特征離子峰，見圖4。樣品的質(zhì)譜中未出現(xiàn)m/z 327峰，而被m/z341峰取代，推測(cè)在樣品的苯環(huán)上有1個(gè)丙氧基，另外，其CH2和OH連接在哌嗪環(huán)一側(cè)。綜上所述，可推得樣品具體結(jié)構(gòu)，見圖5。

圖3 硫代西地那非Fig.3 Thiosildenafil

圖4 硫代西地那非的特征裂解途徑Fig.4 Characteristic fragmentation pathways of thiosildenafil

另外，質(zhì)譜圖上其余質(zhì)譜峰均與推測(cè)結(jié)構(gòu)相匹配。樣品脫水后得到碎片離子m/z 517.3，并以砜基團(tuán)O=S=O為中心發(fā)生異裂，苯環(huán)與嘧啶環(huán)一側(cè)可得到碎片離子m/z 341.4和m/z 359.3，前者繼續(xù)脫去C3H6，得到碎片離子m/z299.0，而后者繼續(xù)脫去C3H8，得到碎片離子m/z315.2；哌嗪一側(cè)得到碎片離子m/z 129.3，繼而脫去CH2O，產(chǎn)生碎片離子m/z 99.2，再丟失碎片C2H3N，得到碎片離子m/z58.3。碎片離子m/z112.3是由m/z 129.3脫去 OH-自由基而得到的，繼續(xù)脫去CH2N·后，產(chǎn)生碎片離子m/z58.3，樣品具體質(zhì)譜裂解過程見圖6。由此推測(cè)，該樣品結(jié)構(gòu)為5-﹛5-［4-（2-羥乙基）哌嗪磺酰］-2-正丙氧基苯基﹜-1-甲基-3-正丙基-1H-吡啶并 ［4，3-d］嘧啶-7（6H）-硫酮，見圖5。

圖5 樣品推測(cè)結(jié)構(gòu)Fig.5 Possible structure of sample

3.3 核磁共振研究

3.3.1 氫譜研究 硫代西地那非結(jié)構(gòu)和其原子編號(hào)分別見圖3和圖5，核磁數(shù)據(jù)見表2。在樣品1H -1H COSY譜（圖7）中，δ0.94（dt，6H，J= 7.4，11.0 Hz）與δ1.74（m，4H）之間存在鄰位耦合，可推測(cè)其分別為-CH2CH3中的CH3與CH2。δ2.81（t，2H，J=7.5Hz）、δ4.14（t，2H，J= 6.5Hz）和δ1.74之間存在鄰位耦合，H-29與O相連，化學(xué)位移增加，所以δ2.81和δ4.14分別為H-25和H-29。δ7～8之間的3個(gè)苯環(huán)信號(hào)峰δ 7.39（d，1H，J=8.9Hz）、δ7.84（dd，1H，J=2.4，8.8Hz）和δ7.91（d，1H，J=2.4Hz）分別為H-12、H-13和H-15。δ4.44（s，3H）為N上CH3，因?yàn)槭艿絅的影響，故向高場(chǎng)方向移動(dòng)。δ1.36（s，1H）為OH上氫。δ2.50（m，4H）與δ2.89（s，4H）之間存在鄰位耦合，推測(cè)為哌嗪環(huán)上18、19、20、21位的8個(gè)氫。因?yàn)镠-18，H-22靠近磺?；?，故化學(xué)位移向高場(chǎng)方向移動(dòng)，因此δ2.50為H-19和H-21，而δ2.89為H-18和H-22。δ3.42（dd，2H，J=5.5，10.6Hz）與δ2.38（s，2H）之間存在鄰位耦合，而且H-34與OH相鄰，所以δ3.42為H-34，而δ2.38為H-33。δ3.32（s，2H）為水峰，與DMSO-d6中水峰的情況相符［18］。樣品氫譜的具體歸屬情況見圖8。

圖6 樣品質(zhì)譜裂解過程Fig.6 Fragmentation pathways of sam ple

3.3.2 碳譜研究 碳譜中有22種不同化學(xué)環(huán)境的C，其中有1個(gè)被DMSO-d6的溶劑峰所掩蓋，放大局部后可以觀察到。其中，δ46.1和δ52.2分別存在2個(gè)C，所以碳譜顯示樣品共含有24個(gè)C，和氫譜推測(cè)吻合。在SP雜化的C中，C-18、C-19、C-21、C-22、C-24和C-33分別與N相連；C-29和C-34分別與氧相連；C-25、C-26、C-27、C-30和C-36分別與 C相連，故處于高場(chǎng)位置。因此，δ10.6、δ14.0、δ21.8、δ22.0和δ27.2分別為C-36、C-27、C-26、C-30和C25。低場(chǎng)位置依次是與N相連的6個(gè)C和與O相連的2個(gè)C，所以δ 39.3為C-24；δ46.1為C-18和C-22；δ52.2為C-19和C-21；δ58.6為C-33；δ59.7為C-34；δ 70.8為C-29。另外，處于化學(xué)位移最低場(chǎng)位置的是δ172.2，為C-1。剩下信號(hào)均能和氫譜推測(cè)吻合，樣品碳譜的具體歸屬情況見圖9。

表2 硫代西地那非與樣品核磁數(shù)據(jù)Tab.2 NMR data of thiosildenafil and samples

圖7 樣品1H-1H COSY譜Fig.71H-1H COSY spectrum of sam p le

4 結(jié)論

圖8 樣品核磁共振氫譜Fig.81H-NM R spectrum of sam p le

圖9 樣品核磁共振碳譜Fig.913C-NMR spectrum of sample

從樣品勃爾特膠囊中分離出西地那非類非法添加物，同時(shí)通過質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)確定其結(jié)構(gòu)為5-﹛5-［4-（2-羥乙基）哌嗪磺酰］-2-正丙氧基苯基﹜-1-甲基-3-正丙基-1H-吡啶并［4，3-d］嘧啶-7（6H）-硫酮。該化合物鮮有報(bào)道，而且未見其藥理和毒理方面的文獻(xiàn)資料，因此尚不明確它對(duì)人體可能產(chǎn)生的潛在危害，需密切關(guān)注。

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Adulterated PDE5inhibitor separated and identified from healthy products of prom oting sexual enhancement

HUANG Guo-dong1， HUANG Yan-ting2， CHEN Lin1， LEIYi2*， ZHANG Rong1*
（1.College of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Guangdong Institute for Food and Drug Control，Guangzhou 510180，China）

AIMTo purify and identify the adulterated PDE5in healthy products of promoting sexual enhancement，and to provide technical supportand related spectraldata for the supervision and inspection.METHODSThe separation and purification of the adulterated was performed using TLC（thin layer chromatography），CC（column chromatography）and HPLC（high performance liquid chromatography）.NMR（nuclearmagnetic resonance）and MS（mass spectrometer）were used for the determination of the chemical structure.RESULTSYellow needle crystal，whose purity was up to 97%，was obtained，and its structure was proved to be 5-﹛5-［4-（2-hydroxyethyl）piperazin）sulfonyl］-2-propoxyphenyl﹜-1-methyl-3-propyl-1H-pyrazolo［4，3-d］pyrimidine-7（6H）-thione.CONCLUSIONThe constituents obtained from Bulte Capsules are rarely reported，so we should pay close attention to it.

healthy productsofpromoting sexualenhancement；adulterated；PDE5inhibitor；isolatation and identification；5-﹛5-［4-（2-hydroxyethyl）piperazin）sulfonyl］-2-propoxyphenyl﹜-1-methyl-3-propyl-1H-pyrazolo［4，3-d］pyrimidine-7（6H）-thione

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1249-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.020

2014-07-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （20903026）；廣州市健康產(chǎn)品非法添加化學(xué)成分快速檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目 （2013）；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目 “食品藥品安全快速檢測(cè)技術(shù)及配套儀器產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用 （2013B090200059）”

黃國(guó)棟 （1988—），男，碩士，研究方向?yàn)榛衔镨b定及構(gòu)效關(guān)系。Tel：13828472068，E-mail：hgd0924@163.com

*通信作者：張 榮（1978—），女，博士，教授，研究方向?yàn)槭称匪幤窓z測(cè)。E-mail：zhangr_zju@hotmail.com雷 毅（1977—），男，博士，主任藥師，研究方向?yàn)槭称匪幤窓z測(cè)。E-mail：Leiy04@qq.com

該化合物鮮有報(bào)道，需密切關(guān)注。