桉葉提取物抗菌作用及主要揮發(fā)性成分的年度變化

陶 奕， 殷 夢， 張皓冰*

（1.中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所；世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心；衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室，上海200025；2.上海醫(yī)藥高等專科學(xué)校，上海201318）

桉葉提取物抗菌作用及主要揮發(fā)性成分的年度變化

陶 奕1， 殷 夢2， 張皓冰1*

（1.中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所；世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心；衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點實驗室，上海200025；2.上海醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，上海201318）

目的分析云南省臨滄市永德縣10年樹齡赤桉、藍桉和大葉桉的葉片提取物中揮發(fā)性成分的含有量變化情況，并研究其抑菌作用。方法連續(xù)12個月采摘3種桉葉片，陰干后分別用二氯甲烷和無水乙醇超聲提取，對兩提取物進行GC/MS分析，并用瓊脂平板擴散法測定其抑菌活性。結(jié)果藍桉含揮發(fā)性成分量最高，赤桉最低。無水乙醇桉葉提取物的抗菌活性均強于二氯甲烷桉葉提取物，對革蘭氏陽性菌的抑制作用均強于對革蘭氏陰性菌，但桉葉的主要成分1，8-桉葉油素抑菌活性很弱。結(jié)論同一月份3種桉葉提取物以及同一種桉葉不同月份提取物的揮發(fā)性成分含有量和抗菌活性均有差異，而且其抑菌成分可能與1，8-桉葉油素相關(guān)不大，需作進一步研究。

赤桉；藍桉；大葉桉；革蘭氏陽性菌；革蘭氏陰性菌；抗菌作用

致病菌對抗生素廣泛產(chǎn)生耐藥性一直是臨床醫(yī)學(xué)最棘手的難題。尋找新的抗生素，是一項急迫而長期的任務(wù)。從1981年到2010年批準(zhǔn)上市的1355個新藥中，約71%直接或間接來自于天然產(chǎn)物。在1 073個新化學(xué)實體 （NCE）小分子藥物中，約64%直接或間接地來源于天然產(chǎn)物［1］。因此，從天然產(chǎn)物中篩選結(jié)構(gòu)新穎的抗菌藥物，是發(fā)現(xiàn)新抗生素的主要途徑之一［2］。

桉樹是桃金娘科Myrtaceae桉屬Eucalyptus植物的統(tǒng)稱，起源于澳洲大陸，1890年引種我國，迄今約有300多種［3］。多年以來，已有大量實驗證實桉葉精油及有機溶劑提取物對各類細(xì)菌有抑制作用，研究范圍涉及各種桉樹品種［4-5］、桉樹的不同部位［6］、不同的提取溶劑［7］及針對不同類別的細(xì)菌。桉樹品種涵蓋了包括藍桉［8-9］、油桉［6］、二色桉、 綜 桉［10］、 尤 曼 桉［11］、 檸 檬 桉［12］、 大 葉桉［13-14］、 赤桉、 托里桉［15-16］、 尾葉桉［17］以及廣林9號［7，18］等多種品種，抑制活性試驗涵蓋了革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌和霉菌等且證實普遍具有活性。如藍桉精油對大腸桿菌、金黃葡萄球菌、幽門螺旋桿菌有活性［9，19］；赤桉葉提取物對枯草芽孢桿菌、差異檸檬酸桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷氏菌、綠膿桿菌、鼠傷寒桿菌具有抗菌活性；大葉桉、檸檬桉、尤曼桉 （A、B）葉片的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和黃瓜枯萎病菌均有抑制作用［4］。大葉桉葉精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用［5］。以及采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮和石油醚分別提取大葉桉葉活性物質(zhì)，以甲醇和95%乙醇提取物的抑菌作用最為明顯［6］。而尾葉桉葉精油對細(xì)菌和真菌均有抑菌效果，其中對桔青霉菌抑菌效果最好，對金黃色葡萄球菌的效果次之，對大腸桿菌的抑菌效果最差［16］；廣林九號桉葉的水提液、石油醚萃取物、三氯甲烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取后剩余物對各供試菌株的藥敏試驗結(jié)果顯示，有效部位為乙酸乙酯組分、正丁醇組分及萃取后剩余組分［7］。其桉葉精油對細(xì)菌和霉菌的抑菌效果有所差異，水煎液對金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌 （非O1群）、溶藻弧菌、蠟狀芽孢桿菌等均有活性［17］。在譚滿良等的綜述中，綜述了10種桉葉提取物的抑菌作用，涉及豆刺盤孢、番茄萎蔫病菌、稻長蠕孢、菜豆殼球孢、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等20種菌［20］。

本研究連續(xù)12個月收集了云南臨滄地區(qū)的赤桉Eucalyptus camaldulensis Dehnh、藍桉E.globulus Labill和大葉桉E.robusta Smith成熟葉片，采用二氯甲烷及無水乙醇提取其低極性和高極性成分，并采用凝膠平板擴散法測試了不同月份提取物的抑菌活性。希望通過觀察一年中其成分和抑菌作用的變化，推測其有效組分。本實驗采用氣質(zhì)聯(lián)用 （GC/ MS）技術(shù)分析了低極性提取物中的一些常見揮發(fā)性成分，并測試了其二氯甲烷和無水乙醇粗提物對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌等4種常見菌的抑菌作用，為后續(xù)譜-效關(guān)系及有效成分分析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 樣品 赤桉Eucalyptus camaldulensis、藍桉Eucalyptus globulus和大葉桉Eucalyptus robusta三種樹葉均為約10年樹齡的桉樹成熟葉片，采自云南省臨滄市永德縣勐底農(nóng)場十隊林場，由林場專家楊安川負(fù)責(zé)采集和鑒別。每月月底采集1次共12次，于通風(fēng)處陰干備用。

1.1.2 試劑 藍桉精油（0.89 g/mL，吉安市福達天然藥用油廠）；1，8-桉葉油素 （99.5%，0.90 g/mL，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司）；β-蒎烯（96.4%，0.85 g/mL，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司）；鹽酸萬古霉素 （注射用，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠）；亞胺培南西司他丁鈉 （注射用，深圳市海濱制藥有限公司）；蛋白胨 （OXOID）、牛肉膏和瓊脂末 （北京索萊寶科技有限公司）；革蘭氏陰性菌大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli，GIM編號ATCC8739）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，GIM編號ATCC9027），以及革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，GIM編號ATCC65387）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，GIM編號ATCC12228）（真空冷凍干燥菌種，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心）。

1.2 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI R-215，瑞士BUCHI公司）；超聲清洗儀 （DS-851007，中國上海生析超聲儀器有限公司）；手提式高速粉碎機（DFT-50，浙江溫嶺市林大機械有限公司）；電子天平 （JA2003N，上海精科天美天平儀器廠）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-GC/5975C-MS，HP-5MS 5%Phenyl Methyl Siloxane30 m×0.25μm× 0.25 mm，美國安捷倫公司）及NIST2008譜庫（美國國家科學(xué)技術(shù)研究所）；模擬氣候箱 （法國法萊寶公司Froilabo MEDITEST H600）。

2 方法與結(jié)果

2.1 桉葉粗提物的制備 將干燥的桉葉粉碎后依次用二氯甲烷和無水乙醇超聲提取，分別將兩種溶劑的提取液旋蒸至干，稱定質(zhì)量并計算得率。3種桉葉中，藍桉的二氯甲烷提取物得率最高，平均為13.5%，無水乙醇提取物得率最低，為6.17%；大葉桉的無水乙醇提取物得率最高，平均為14.25%，而二氯甲烷提取物得率最低，為7.17%。三者的平均總得率相近，為19.67% ～21.42%。說明藍桉的低極性物質(zhì)即揮發(fā)油含有量較高，而赤桉和大葉桉的高極性物質(zhì)含有量較高。

2.2 桉葉二氯甲烷粗提物的GC/MS分析

2.2.1 供試液配制 二氯甲烷粗提物用丙酮配制成1 mg/mL溶液，內(nèi)標(biāo)物采用二氯吩噻嗪，用丙酮配置成0.1 mg/mL溶液，進樣前將樣品溶液700μL和內(nèi)標(biāo)溶液300μL混勻，0.22μm濾膜過濾備用。

2.2.2 氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）分析 載氣為氮氣，輔助氣為氦氣，體積流量1 mL/min；不分流進樣；進樣口溫度 250℃；接口溫度 310℃；程序升溫；總分析時間為195 min。

2.2.3 相對峰面積、相對保留時間與含有量變化分析 各成分的含有量變化根據(jù)相對峰面積變化作半定量分析。相對峰面積的計算方法為：各成分峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積。相對保留時間的計算方法為：各峰校正保留時間/內(nèi)標(biāo)峰校正保留時間。

2.2.4 方法學(xué)驗證 取1月份采摘的藍桉葉及其二氯甲烷提取物進行方法學(xué)驗證。

2.2.4.1 儀器精密度考察 將藍桉二氯甲烷提取物制備成樣品供試液進行GC/MS分析。連續(xù)進樣5次，選取1，8桉葉油素、蒎烯、香橙烯、藍桉醇、松香芹醇峰，分別計算各峰相對保留時間RSD值（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，Relative standard deviation）和各峰相對峰面積RSD值。測定結(jié)果表明各峰相對保留時間RSD均＜1%，各峰相對峰面積的RSD均＜1%，儀器精密度良好。

2.2.4.2 方法重復(fù)性考察 取同一份藍桉葉粉末，按二氯甲烷提取物制備方法平行制備5份樣品供試液進行GC/MS分析，選上述峰，分別計算各峰相對保留時間RSD值和各峰相對峰面積RSD值。測定結(jié)果表明各峰相對保留時間RSD均＜1%，各峰相對峰面積的RSD均＜1%，方法重復(fù)性良好。

2.2.4.3 樣品穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液，室溫條件下放置，按照樣品測定方法于0、2、4、8、12 h后進樣，選上述峰，計算相對保留時間RSD值和各峰相對峰面積RSD值。測定結(jié)果表明各峰相對保留時間RSD均＜1%，各峰相對峰面積的RSD均＜1%，樣品穩(wěn)定性良好。

2.3 3種桉葉的常見揮發(fā)性成分在12個月中的含有量變化 不同月份桉葉中所含物質(zhì)種類以及含有量均有變化。1，8-桉葉油素在藍桉中含有量最高，赤桉中最低。其他幾種揮發(fā)性成分，如蒎烯、香橙烯及藍桉醇等的含有量也是在藍桉中相對較高，在赤桉中最低，且成分也更加復(fù)雜。圖1為3種桉葉中幾種主要揮發(fā)性成分的含有量變化趨勢圖。

圖1 3種桉葉常見揮發(fā)性成分及其年度變化Fig.1 Annual changes of common volatile constituents in 3 species of eucalyptus leaves extracts

2.4 藍桉精油的GC/MS分析 藍桉精油中主要成分為1，8-桉葉油素。從歸一化峰面積分析，含有量超過85%，其他成分為莰烯、蒎烯、水芹烯和松油醇等共計15種。

2.5 抑菌試驗

2.5.1 供試液及對照品的配制 二氯甲烷提取物、桉葉精油、1，8-桉葉油素及β-蒎烯均以二甲基亞砜（DMSO）配制成400 mg/mL溶液；無水乙醇提取物用6%DMSO配制成500 mg/mL供試液，再采用連續(xù)二倍稀釋法，配制成質(zhì)量濃度分別為1/2，1/ 4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，1/ 512，1/1 024 g/mL的共10個質(zhì)量濃度的供試藥液。亞胺培南西司他丁鈉和萬古霉素分別以無菌去離子水配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的藥液。

2.5.2 抑菌活性測定 培養(yǎng)基配制方法參照文獻［21］，抑菌活性測定采用瓊脂平板擴散法［22］。菌株活化并稀釋后，將菌懸液均勻涂布到培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，在培養(yǎng)基上打直徑6 mm孔，向每孔中加入100μL供試藥液。二氯甲烷提取物的空白對照組為分析純DMSO；無水乙醇提取物的空白對照為6%DMSO溶液，設(shè)亞胺培南西司他丁鈉 （革蘭氏陰性菌抗菌藥物）對照組和萬古霉素 （革蘭氏陽性菌抗菌藥物）對照組；桉葉成分對照組為藍桉精油、1，8-桉葉油素和β-蒎烯，各組設(shè)3個重復(fù)試驗，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，游標(biāo)卡尺測量加藥孔邊緣至抑菌圈邊緣的距離，即抑菌圈寬度。

2.5.2.1 二氯甲烷提取物的抑菌活性 3種桉葉的二氯甲烷提取物對銅綠假單胞菌的抑制作用均不佳，約2/3的樣品對銅綠假單胞菌的抑菌圈環(huán)寬度為0。除大葉桉6月份樣品對大腸桿菌抑制作用較佳，抑菌環(huán)寬度接近6 mm外，其他樣品對革蘭氏陰性菌的作用均遠遠低于對革蘭氏陽性菌的抑制?？偟恼f來，各種桉葉的二氯甲烷提取物對各種菌的作用基本相當(dāng)。其中，以大葉桉的二氯甲烷粗提物對表皮葡萄球菌的作用為最佳。3種對照品中，藍桉精油對4種菌均有較好的抑制作用。在400 mg/mL質(zhì)量濃度下，對大腸桿菌的抑菌圈寬度為6.5 mm，銅綠假單胞菌5.52 mm，金黃葡萄球菌10.24 mm，表皮葡萄球菌的抑菌圈寬度 ＞20 mm。GC/MS分析表明，藍桉精油其主要成分為1，8桉葉油素，其歸一化峰面積占85%以上，其他成分有松油醇、水芹烯、莰烯、蒎烯及蒎烯的雙鍵異構(gòu)體等。抑菌試驗表明，1，8-桉葉油素對革蘭氏陰性菌沒有作用，同樣，另一種較為常見的成分β-蒎烯除對表皮葡萄球菌有一定作用外，對革蘭氏陰性菌無作用，對金黃色葡萄球菌幾乎沒有作用。圖2為3種桉葉對4種菌的抑制作用隨采摘月份的變化。

圖2 3種桉葉二氯甲烷提取物的抑菌活性及其年度變化Fig.2 Annual changes of bacteriostatic activities of dichloromethane extracts from 3 species of eucalyptus leaves

2.5.2.2 無水乙醇粗提物抑菌作用觀察 從抑菌圈數(shù)據(jù)觀察，3種桉葉的無水乙醇粗提物活性相當(dāng)，對4種常見菌的作用強于二氯甲烷提取物，對G+和G-均有較好的活性，對銅綠假單胞菌的抑菌活性最低，當(dāng)稀釋至7.81 mg/ML時基本上不再有抑制作用；對表皮葡萄球菌仍有明顯活性，當(dāng)稀釋到0.98 mg/mL時，依然能觀察到明顯的抑制作用。稀釋至31.25 mg/ML時，其抑菌作用與二氯甲烷提取物在400 mg/mL的質(zhì)量濃度下相當(dāng)。不同種桉葉以及同種桉葉的不同月份樣品抑菌作用有一定差異。3種桉葉的醇提物均對表皮葡萄球菌作用最好，對銅綠假單胞菌作用最差。圖3為31.25 mg/mL質(zhì)量濃度下各桉葉無水乙醇提取物對4種常見菌的抑菌圈數(shù)據(jù)隨采摘月份的變化。

圖3 桉葉乙醇提取物對4種細(xì)菌的抑制作用及其年度變化Fig.3 Annual changes of bacteriostatic activities of ethanol extracts from 3 species of eucalyptus leaves

2.5.2.3 對照品抑菌作用 藍桉精油的抑菌活性遠好于二氯甲烷提取物，其對金黃葡萄球菌抑菌圈寬度為10.24 mm，對表皮葡萄球菌的抑菌圈寬度大于20 mm，對革蘭氏陰性菌活性較差，對大腸桿菌抑菌圈寬度為6.5 mm，對銅綠假單胞菌抑菌圈寬度為5.52 mm。但其主要成分1，8-桉葉油素抑菌活性很弱，對革蘭氏陰性菌無效，對革蘭氏陽性菌的活性也很差，對金黃葡萄球菌活性僅為2.27 mm，對表皮葡萄球菌抑菌圈寬度為2.18 mm，β-蒎烯對革蘭氏陰性菌無效，對金黃葡萄球菌抑菌圈寬度僅為0.79 mm，對表皮葡萄球菌活性稍好，抑菌圈寬度為6.24 mm。

3 討論

本實驗對12個月連續(xù)采摘的3種桉葉提取物抑菌活性進行了分析，并對二氯甲烷提取物中幾種常見的揮發(fā)油成分變化進行了初步分析。根據(jù)GC/ MS圖譜，藍桉二氯甲烷提取物中1，8-桉葉油素含有量在12個月中雖有波動，但均遠高于其他各成分含有量。而大葉桉除在9月份樣品中稍高外，其他月份中含有量均不高。有報道認(rèn)為，具有抗菌活性的主要成分為1，8-桉葉油素、斯巴醇、反式松香芹醇、α-蒎烯、對傘花烴、藍桉醇、隱品酮、β-水芹烯、白千層醇、龍腦莰醇、檸檬烯和異匙葉桉油醇等。采用提取自桉樹不同部位的精油進行色質(zhì)聯(lián)用分析和抗革蘭氏陽性菌和陰性菌的活性試驗，可觀察到一些主要成分含有量與抗菌活性有相關(guān)性，其含氧單萜 （尤其是1，8-桉葉油素）含有量與抗菌活性有較高相關(guān)性［6］。分析結(jié)果顯示，同一月份不同種桉葉提取物以及同一種桉葉不同月份樣品提取物的抑菌活性均有差異，GC/MS分析中也觀察到其成分亦有較大的差異。雖然1，8-桉葉油素的含有量在不同月份中不同，但在大多數(shù)樣品中都是含有量最高或較高的成分。本實驗中，藍桉精油對4種常見菌的抑菌活性很好，但其含有量超過85%的主要成分1，8-桉葉油素活性很差。而且我們還觀察到，3種桉葉中，1，8-桉葉油素含有量最高的藍桉二氯甲烷提取物，其抑菌活性并不強于甚至低于含有量較低的大葉桉或赤桉的二氯甲烷提取物。有人認(rèn)為，1，8-桉葉油素是通過促進其他萜類活性成分穿透細(xì)胞膜而達到滅菌的效果［23］。

植物次生代謝產(chǎn)物隨環(huán)境和氣候的變化而變化，不同時間采收的葉片提取物，其活性也會表現(xiàn)出不同。生物活性測試結(jié)果表明，桉葉提取物具有殺滅釘螺、抑菌以及抗包蟲原頭蚴等活性。對不同月份樣品或不同樹種樣品的成分與不同生物活性的進行關(guān)聯(lián)性分析和構(gòu)-效關(guān)系分析，將有助于推測該類植物中針對不同活性的活性成分。雖然本實驗采摘的葉片樣本均出自于同一林場，但各項數(shù)值變化的規(guī)律性似乎并不強。因此，我們考慮進一步縮小采集范圍，以期獲得更具規(guī)律性的樣本用于滅螺、抑菌以及抗寄生蟲作用的譜-效關(guān)系及化合物構(gòu)-效關(guān)系的分析。后續(xù)試驗尚在進行中。

此外，在本實驗中，樣品擴散能力也可能影響抑菌圈的大小。乙醇提取物的擴散效果好于二氯甲烷提取物，這也可能在一定程度增加了兩種不同溶劑提取物的抑菌圈數(shù)據(jù)差異。

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Annual changes of antibacterial activities and major volatile constituents in leaf extracts froMeucalyptus

TAO Yi1， YIN Meng2， ZHANG Hao-Bing1*
（1.National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Diseases Control and Prevention；WHO Collaborating Centre for Malaria，Schistosomiasis and Filariasis；Key Laboratory of Parasite and Vector Biology，National Health and Family Planning Commision of The People's Republic of China，Shanghai 200025，China；2.ShanghaiMedical School，Shanghai201318，China）

AIMTo analyze the content changes of volatile components in the leaf extracts froMthe 10-yearold eucalyptus（Eucalyptus camaldulensis Dehnh，E.globulus Labill，and E.robusta Smith）picked froMYongde County，Lincang City，Yunnan Province，and to explore their antibacterial activities.METHODSFor twelve consecutivemonths，three kinds ofmature leaveswere collected and dried in the shade and ultrasonically extracted with dichloromethane and absolute ethanol，respectively.The analyses of two extracts were performed on GC/MS，their antibacterial activitiesweremeasured by the agar disc diffusionmethod.RESULTSOf the volatile components contents，E.globulus was themost，and E.Camaldulensis was the least.The antibacterial activity of absolute ethanol extract of the eucalyptuswas stronger than thatof dichloromethane extract.The bacteriostatic activity of both dichloromethane and ethanol extracts against gram-positive bacteria were better than these extracts against gram-negative bacteria.But1，8-eucalyptol，one of themain components，presented poor bacteriostatic activity against both G-and G+bacteria.CONCLUSIONThere are the differences in bacteriostatic activities of three species of eucalyptus leaf extracts in the samemonths，and the same leaves in variousmonths.The activity has little connection with 1，8-eucalyptol.The further study is needed.

Eucalyptus camaldulensis Dehnh；Eucalyptus globules Labill；Eucalyptus robusta Smith；grampositive bacteria；gram-negative bacteria；bacteriostatic activity

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1050-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.027

2014-11-20

國家國際科技合作專項 （2010DFA33970）；國家國際科技合作專項 （2014DFA31130）

陶 奕（1967—），女，從事儀器分析及藥物質(zhì)量研究。Tel：（021）64377008-2606，E-mail：taoyi20032003@163.coM*通信作者：張皓冰 E-mail：zhang-haobing@163.com