響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取中藥茜草中多糖工藝

張海容， 劉 娟， 魏增云， 陳金娥

(1. 山西省忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000;2. 山西省忻州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西忻州034000)

茜草Radix Rubiae 是常用的傳統(tǒng)中藥，又名活血草、地血、鋸子草、血見(jiàn)愁等，其性寒、味苦、歸心肝經(jīng)，具有涼血止血、活血祛瘀、祛風(fēng)除濕、祛瘀通經(jīng)、止咳祛痰的功效，古時(shí)除作藥用外，還用作染料，其有效成分有茜草素、蒽酮、肽類、萘醌及其苷類化合物、萜類、多糖類等［1-2］?，F(xiàn)代藥理研究表明［3-4］，茜草多糖除了能作為儲(chǔ)能物質(zhì)和結(jié)構(gòu)支持物質(zhì)外，還具有護(hù)肝、止血、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抑制人表皮細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，防御細(xì)菌或病毒感染等生物活性，因此快速高效提取茜草多糖，對(duì)中藥活性成分研究與開(kāi)發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

超聲提取是應(yīng)用超聲波強(qiáng)化提取的方法，對(duì)媒質(zhì)主要產(chǎn)生獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)和空化作用［5-6］，具有選擇性高、提取時(shí)間短以及不需要特殊的分離步驟等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將用超聲—響應(yīng)面法提取茜草多糖，該方法具有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高、適用于多因素和多水平試驗(yàn)等優(yōu)勢(shì)，在食品、化學(xué)和生物優(yōu)化過(guò)程中被廣泛使用［7-9］，可為工業(yè)化生產(chǎn)藥物多糖提供理論參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料 AL204 電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);723 可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);KQ-400KDE 高功率數(shù)控超聲波清洗器(400 W，昆山市超聲儀器有限公司)。

茜草(產(chǎn)地河北，忻州市鹿林大藥房);葡萄糖為分析純(北京化學(xué)試劑公司);苯酚為分析純(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);濃硫酸(天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 移液管精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)，置于9 支比色管中，用二次蒸餾水補(bǔ)充至2 mL，然后加入5%苯酚溶液1 mL 和98%濃硫酸5 mL，靜止0.5 h，冷卻至室溫后，在最大吸收波長(zhǎng)490 nm 處，以空白試劑為參比，測(cè)定吸光度值。然后，以吸光度值為縱坐標(biāo)(A)，質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(C)繪制工作曲線，得到回歸方程A=0.053 2C-0.010 5，R2=0.999 5。

1.2.2 茜草多糖的測(cè)定 將茜草粉碎并過(guò)篩后，準(zhǔn)確稱取0.200 g，置于錐形瓶中，加入一定體積的二次蒸餾水，在選定的不同超聲條件下提取茜草多糖。然后，趁熱抽濾，收集濾液，將其稀釋5 倍，進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

苯酚-硫酸法［10］是測(cè)定多糖含有量的常用方法。準(zhǔn)確吸取稀釋后的濾液2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL 和98%濃硫酸5 mL，以不加苯酚和濃硫酸的樣品溶液為參比，靜置0.5 h，冷卻至室溫后，在最大吸收波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算茜草多糖的產(chǎn)率，計(jì)算公式如下。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 影響超聲提取茜草多糖的因素很多，本實(shí)驗(yàn)選取超聲功率、溫度、時(shí)間、料液比及提取次數(shù)為因素，考察其對(duì)茜草多糖提取工藝的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，多糖產(chǎn)率在超聲功率240 W、液料比40 mL/g、溫度55 ℃、時(shí)間6 min、提取2 次時(shí)最高，本實(shí)驗(yàn)中，選取功率(A)、溫度(B)、液料比(C)、時(shí)間(D)這四個(gè)因素進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)［11-13］，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化茜草多糖提取工藝的條件，見(jiàn)表1。

表1 Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)

2.1.1 超聲提取功率對(duì)茜草多糖產(chǎn)率的影響 其他因素不變，在160、240、320、400 W 下進(jìn)行超聲提取，結(jié)果見(jiàn)圖1A。從圖可知，隨著超聲功率增加，茜草多糖的產(chǎn)率逐漸提高，但在功率240 ～320 W 處，產(chǎn)率上升幅度不明顯，考慮到節(jié)省能源及超聲儀器功率限制，故選取240 W 為最佳功率。

2.1.2 液料比對(duì)茜草多糖產(chǎn)率的影響 其他因素不變，按液料比20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1B。從圖可知，液料比的增加對(duì)茜草多糖產(chǎn)率的影響較大。在液料比約為40 ∶1 時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到最大，但大于40 ∶1 時(shí)，產(chǎn)率反而下降。因此，從經(jīng)濟(jì)節(jié)約角度考慮，選擇液料比40 ∶1 左右為宜。

2.1.3 溫度對(duì)茜草多糖產(chǎn)率的影響 其他因素不變，在35、45、55、65、75 ℃溫度下進(jìn)行提取，結(jié)果見(jiàn)圖1C。從圖可知，隨著溫度的升高，茜草多糖的產(chǎn)率逐漸提高，但達(dá)到55 ℃后，產(chǎn)率基本無(wú)太大增加，可能是由于溫度過(guò)高而導(dǎo)致多糖降解，故選取55 ℃為最佳提取溫度。

2.1.4 時(shí)間對(duì)茜草多糖產(chǎn)率的影響 其他因素不變，在2、4、6、8、10 min 進(jìn)行提取，結(jié)果見(jiàn)圖1D。從圖可知，隨著時(shí)間的增加，茜草多糖的產(chǎn)率逐漸提高，而在6 min時(shí)產(chǎn)率最高。因此，最佳的超聲時(shí)間為6 min。

圖1 不同因素對(duì)茜草多糖產(chǎn)率的影響

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)茜草多糖產(chǎn)率的影響 準(zhǔn)確稱取樣品0.2 g，在上述條件下提取一次，進(jìn)行吸光度檢測(cè)。然后，收集所得殘?jiān)?，在相同條件下進(jìn)行第二和第三次提取，并計(jì)算多糖產(chǎn)率，通過(guò)比較來(lái)確定最佳提取次數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，為了節(jié)省能源的消耗，選擇提取次數(shù)為2 次。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化茜草多糖實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到響應(yīng)面分析結(jié)果及其預(yù)測(cè)值，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 提取次數(shù)對(duì)茜草多糖產(chǎn)率的影響

表2 響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

利用Design-Expert 軟件，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到回歸方程P =8.73 +0.018A +0.13B -0.053C +0.010D - 0.10AB - 0.077AC - 0.13AD - 0.033BC -0.045BD-0.045CD -0.38A2-0.47B2-0.60C2- 0.51D2，對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知，本實(shí)驗(yàn)所選模型的P ＜0.000 1，說(shuō)明回歸方程在描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其因變量與全體自變量之間的線性關(guān)系極顯著，表明該方法非?？煽俊Ａ硗?，在所選因素水平范圍內(nèi)，對(duì)結(jié)果影響的排序?yàn)闇囟龋玖弦罕龋竟β剩緯r(shí)間，而且變異系數(shù)較低(CV 為2.47%)，說(shuō)明該方法具有良好的穩(wěn)定性。同時(shí)，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.895 2，說(shuō)明模型可靠性較好，89.52%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也與模型一致。除此之外，失擬項(xiàng)＞0.05，不顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，可用于茜草多糖提取的分析與預(yù)測(cè)。

2.3 響應(yīng)面圖分析 由回歸方程繪制出響應(yīng)面分析圖，該圖直觀反映了各因子的交互作用，當(dāng)提取時(shí)間為6 min 時(shí)，提取溫度55 ℃與功率240 W 對(duì)多糖提取產(chǎn)量的交互作用顯著;溫度55 ～60 ℃、液料比40 mL/g 時(shí)，提取溫度與水體積對(duì)多糖提取產(chǎn)量的交互作用顯著，而且對(duì)其濃度改變較大;提取功率和液料比接近零時(shí)，多糖的提取濃度最高，可見(jiàn)兩因素交互作用非常明顯，而且茜草多糖產(chǎn)率的最高點(diǎn)出現(xiàn)在各因素的零水平附近處。由此，在交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響中，可看出超聲時(shí)間和功率、溫度和功率、液料比和溫度的影響較為顯著，與方差分析基本一致，見(jiàn)圖3。

表3 模型的方差分析

3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

對(duì)回歸方程P = 8.73 + 0.018A + 0.13B - 0.053C +0.010D - 0.10AB - 0.077AC - 0.13AD - 0.033BC -0.045BD-0.045CD -0.38A2-0.47B2-0.60C2-0.51D2取一階偏導(dǎo)，得到四個(gè)四元一次方程組0.018 - 0.1B -0.077C- 0.13D - 0.76A = 0、0.13 - 0.1A - 0.033C -0.045D-0.94B =0、0.053 +0.077A +0.033B +0.045D +1.2C=0、0.01 -0.13A -0.045B -0.045C -1.02D =0。然后對(duì)其求解，計(jì)算出A = 0.016 845、B = 0.132 17、C =0.041 03、D=0.000 131，最后求得最佳超聲功率(A)為241.3 W，最佳溫度(B)為56.3 ℃，最佳液料比(C)為40.4 ∶1，最佳提取時(shí)間(D)為6 min，該條件下茜草多糖的最大理論產(chǎn)率為8.73%。由于實(shí)驗(yàn)條件限制，修正后的各實(shí)際影響因素分別為功率240 W、溫度56 ℃、液料比40 ∶1、提取時(shí)間6 min。在此條件下，茜草多糖的產(chǎn)率為8.75%，與理論值8.73%接近，證明該模型的準(zhǔn)確性、可靠性及重要的使用價(jià)值。

4 超聲提取與常規(guī)熱水法對(duì)比實(shí)驗(yàn) 精密稱取茜草粉末10.0 g，置于500 mL 錐形瓶中，以液料比40 ∶1，在80℃恒溫水浴鍋中加熱8 h，檢測(cè)其濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知，超聲提取法不僅耗能少(提取溫度低)，而且所需時(shí)間縮短80 倍，產(chǎn)率也高于常規(guī)熱水法，說(shuō)明該提取工藝具有節(jié)能高效［14］的優(yōu)越性。

圖3 不同因素對(duì)茜草多糖產(chǎn)率的的相互作用響應(yīng)面圖

表4 超聲波提取法與常規(guī)熱水法提取茜草多糖的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

5 討論

(1)通過(guò)單因素試驗(yàn)，得到超聲提取茜草多糖的最佳工藝條件為超聲功率240 W，超聲溫度55 ℃，液料比40 ∶1，超聲時(shí)間6 min，提取2 次。

(2)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲功率、超聲溫度、料液比、提取時(shí)間這四個(gè)因素進(jìn)行中心組合，用Design-Expert 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，建立了超聲提取茜草多糖的工藝數(shù)學(xué)模型P = 8.73 + 0.018A + 0.13B - 0.053C +0.010D- 0.10AB - 0.077AC - 0.13AD - 0.033BC -0.045BD-0.045CD -0.38A2-0.47B2-0.60C2- 0.51D2，回歸分析表明，該模型穩(wěn)定性較好。通過(guò)模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，因素的主效應(yīng)關(guān)系為溫度＞料液比＞功率＞時(shí)間，相關(guān)系數(shù)R2= 0.895 2，說(shuō)明模型的可靠性較好，89.52%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也與模型一致。

(3)利用由響應(yīng)面法得到的模型進(jìn)行探討，得到茜草多糖優(yōu)化的超聲提取工藝條件為超聲功率240 W，超聲溫度56 ℃，液料比40 ∶1，超聲時(shí)間6 min，提取2 次，茜草多糖的理論產(chǎn)率可達(dá)到8.73%，而實(shí)驗(yàn)值為8.75%，與理論值相符。因此，結(jié)合響應(yīng)面法的茜草多糖超聲提取工藝數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，科學(xué)可行，對(duì)工業(yè)上提取、利用、開(kāi)發(fā)茜草多糖有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

(4)超聲提取與常規(guī)溶劑提取法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用前一方法提取的茜草多糖，其提取率顯著優(yōu)于后者。

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