單味中草藥體內(nèi)外抗乙肝病毒療效的系統(tǒng)評(píng)價(jià)

趙 霏， 安利峰， 馬艷慶， 楊克虎

(1. 西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730030;2. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院循證醫(yī)學(xué)中心，甘肅蘭州730000;3. 甘肅省循證醫(yī)學(xué)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種感染肝的閉合環(huán)狀雙鏈DNA 病毒。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全球超過20 億人感染HBV，在中國(guó)有超過1.2 億人患慢性乙型肝炎，每年約有35 萬的乙肝患者喪生于由HBV 感染所致的肝硬化、肝功能衰竭和肝細(xì)胞癌等疾病［1-2］。目前，臨床治療慢性乙肝的藥物主要有核苷類似物如拉米夫定、恩替卡韋和α-干擾素兩種。然而，由于會(huì)產(chǎn)生明顯耐藥性和劑量相關(guān)副作用，其治療效果均不盡人意［3-4］。傳統(tǒng)中草藥(Chinese herbal medicines，CHM)在治療肝臟疾病方面歷史悠久。據(jù)報(bào)道，中國(guó)治療乙肝藥物中有30% ～50%是低成本和低毒性的中草藥，其中80%的慢乙肝患者依靠中草藥治療［5］。循證醫(yī)學(xué)資料顯示，與西藥相比，在抑制慢乙肝患者HBV e 抗原和表面抗原血清轉(zhuǎn)化以及HBV DNA 復(fù)制方面，中草藥有同等或更好的效果［5-7］。但由于臨床試驗(yàn)的方法學(xué)低質(zhì)量和發(fā)表偏倚，使得無法驗(yàn)證其在治療HBV感染上的價(jià)值。此外，復(fù)雜的草藥制劑和多種成分的中藥配方，使分析中草藥治療乙肝潛在療效和機(jī)制方面有所限制。近年來，在細(xì)胞和動(dòng)物模型上研究中草藥治療HBV 感染效果和機(jī)制的報(bào)道增多。在以感染HBV 細(xì)胞株和感染鴨乙肝病毒(DHBV)的雛鴨為實(shí)驗(yàn)組的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)某些單味中藥提取物或提取物合成的化合物具有抗HBV有效性和廣泛應(yīng)用性。本文通過檢索和評(píng)價(jià)相關(guān)文獻(xiàn)，以期完成中草藥抗HBV 病毒效果的系統(tǒng)分析并描述開發(fā)中草藥對(duì)抗HBV 感染的前景。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索 電子檢索自建庫至2014 年10 月的中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)及PubMed 數(shù)據(jù)庫中的中英文文獻(xiàn)。中草藥中英文檢索詞為中藥、草藥、中草藥、中藥單味、單味中藥、單體中藥、提取物、Chinese medicine、herbal、herbs、single herb、plant、extract、CHM;乙型肝炎中英文檢索詞為乙型肝炎、乙肝、鴨乙肝、鴨乙型肝炎、抗病毒、體內(nèi)外、in vitro、in vivo、hepatitis B、duck hepatitis B、HBV、DHBV。檢索策略為中草藥和乙型肝炎分開檢索，各檢索詞間用OR 連接，二者檢索結(jié)果用AND 連接進(jìn)行二次檢索。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):①單味中藥提取物或提取物混合物抗HBV 的研究;②在細(xì)胞或動(dòng)物模型上分析對(duì)HBV 感染的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究;③體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中報(bào)道藥物抗HBV 的半數(shù)有效濃度 (IC50)、半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(CC50)和治療指數(shù)(TI)等結(jié)局指標(biāo);④體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中報(bào)道藥物對(duì)鴨乙肝病毒抑制率等結(jié)局指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn):①采用多種中草藥組合配方或中藥制劑抗HBV 的研究;②聯(lián)合其他治療方法的研究;③療效評(píng)價(jià)指標(biāo)不明確或無法獲取結(jié)局指標(biāo)的文獻(xiàn);④重復(fù)研究或重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)。

1.3 資料提取 為了評(píng)估單味中藥的抗HBV 療效，在體外實(shí)驗(yàn)中，提取文獻(xiàn)中藥物的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度即使宿主細(xì)胞生存率下降50%時(shí)的藥物濃度(CC50)，和藥物的半數(shù)有效濃度即抑制50%細(xì)胞分泌乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)及釋放HBV DNA 時(shí)的藥物濃度(IC50)，并根據(jù)CC50和IC50計(jì)算出的治療指數(shù)(TI) (TI = CC50/IC50)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，提取藥物對(duì)感染DHBV 鴨治療的劑量(g/(kg·d)-1)，動(dòng)物的數(shù)量，抑制率最高的血漿DHBV DNA 水平和治療持續(xù)時(shí)間以及經(jīng)過3 d 處理后的DHBV DNA 的抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用Excel 表進(jìn)行數(shù)據(jù)的管理和分析。體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提取后按照藥物抑制HBV DNA、HBeAg 和HBsAg 釋放量三方面的治療指數(shù)由高到低進(jìn)行排列，若沒有確切說明CC50和IC50值，但細(xì)胞毒性或抗病毒效果呈劑量依賴性，則當(dāng)某一用藥濃度下細(xì)胞抑制率降低或增長(zhǎng)超過50%時(shí)，治療指數(shù)用“大于” (＞)或“小于” (＜)某一數(shù)值表示。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按照藥物對(duì)感染雛鴨血漿DHBV 抑制率的高低進(jìn)行排列。每組數(shù)據(jù)選取排名前十位的藥物制作統(tǒng)計(jì)表。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選 共檢索到786 篇文獻(xiàn)，經(jīng)篩選符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)共有122 篇文獻(xiàn)，包括66 篇英文和56 篇中文。約81%的文獻(xiàn)(99/122)來自中國(guó)大陸。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)共有91 篇，報(bào)道了從82 種中草藥中提取出的176 種提取物或混合物有抗HBV 效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)所用的HBV 宿主細(xì)胞株包括HepG2.2.15，HB-8064、HepA2 MS-G2，HepG2-N10，HepAD38 細(xì)胞株以及被DHBV 感染的鴨肝細(xì)胞。91%的文獻(xiàn)(83/91)選用HepG2.2.15 細(xì)胞株進(jìn)行研究。符合納入標(biāo)準(zhǔn)的第一篇文獻(xiàn)發(fā)表于1995 年，此后單味中藥提取物體外抗HBV 療效的研究逐年增加，見圖1。

體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)共有31 篇，報(bào)道了從23 種中草藥中提取和組成的30 種物質(zhì)在感染DHBV 雛鴨上的療效。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)中單味中藥提取物抗HBV 效應(yīng) 納入文獻(xiàn)中報(bào)道最多具有抗HBV 效應(yīng)的中草藥包括苦參(11 篇)，大黃(8 篇)、黃芩(4 篇)、黃芪(4 篇)。研究中評(píng)估單味中藥體外抗HBV 效應(yīng)方法主要包括測(cè)量宿主細(xì)胞中HBV DNA 的水平和細(xì)胞上清中HBeAg 和HBsAg 釋放濃度。根據(jù)CC50與IC50比值計(jì)算出的TI 一般用于比較療效和毒性。從24 種中藥中提取出的13 種物質(zhì)和16 種混合物在對(duì)HBV DNA，HBeAg 或HBsAg 有位居前十的治療指數(shù)(表1)。在這三方面的測(cè)量中，從大黃與黃芩中提取出來的大黃酚8-O-β-D-葡萄糖苷和漢黃芩素這兩種化合物在治療指數(shù)方面有較高的價(jià)值。

表1 治療指數(shù)前十位抑制HBV DNA 的單味中藥提取物

2.2.1 通過測(cè)量對(duì)HBV DNA 釋放抑制率評(píng)估單味中藥的抗HBV 效應(yīng) 從8 種中藥中提取出的3 種物質(zhì)和7 種混合物在抑制HBV DNA 釋放量上治療指數(shù)位居前十(表1)。從大黃中提取出來的大黃酚8-O-β-D-葡萄糖苷，是中醫(yī)最常用的草藥配方［6］，在用藥物處理過的HepG2.2.15 細(xì)胞中HBV DNA 釋放量上治療指數(shù)最高(＞270.42)。此外，大黃的乙醇提取物也可抑制HepG2.2.15 細(xì)胞外的HBV DNA顯著減少［8］。在HepAD38 細(xì)胞中也有類似的結(jié)果［9］。同時(shí)，在用8-O-β-D-葡萄糖苷和RPEH 進(jìn)行細(xì)胞治療時(shí)可以發(fā)現(xiàn)HepG2.2.15 細(xì)胞內(nèi)HBV DNA、HBeAg 和HBsAg 水平同時(shí)減少。進(jìn)一步的研究表明，這兩種治療方法都可以減少60%以上的乙肝病毒DNA 復(fù)制中間體，并抑制HBV 聚合酶活性。與10 μg/mL拉米夫定相比，DNA 印跡顯示這兩種物質(zhì)在312.5 μg/mL 的質(zhì)量濃度下抑制HBV DNA 產(chǎn)量有更強(qiáng)的效果，而且大黃酚8-O-β-D-葡萄糖苷在抑制療效方面更有效［8］。

陰陽蓮的水提取物和乙醇提取物均可抑制細(xì)胞內(nèi)HBV DNA 水平［10］。此外，從黃芩中提取出來單類黃酮分子漢黃芩素，可以抑制HepG2.2.15 細(xì)胞外的50%乙型肝炎病毒DNA 的質(zhì)量濃度小于50 μg/mL［11］。MS-G2 細(xì)胞中的研究也表明，不閉合環(huán)狀和線性的HBV DNA 濃度在治療組漢黃芩素作用下顯著降低［12］。

2.2.2 通過測(cè)量對(duì)HBeAg 或HBsAg 分泌量抑制率來評(píng)估抗HBV 效應(yīng) 約90%的文獻(xiàn)報(bào)道通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)來測(cè)量HBeAg 和HBsAg 的分泌。從9 種中藥中提取出來的5種物質(zhì)和5 種混合物能減少HepG2.2.15 細(xì)胞釋放HBeAg，其治療指數(shù)也位居前十(表2)。從珍珠草中提取出的鞣花酸低至0.07 μg/mL 時(shí)就可抑制50% HBeAg 的釋放，其治療指數(shù)最高(＞10 000)。然而，鞣花酸在HepG2.2.15 細(xì)胞中不能阻斷HBV 聚合酶活性和HBV DNA 復(fù)制［13］。此外，與拉米夫定相比，從黃芩中提取出來的漢黃芩素在同一劑量(4 μg/mL)下能更有效地減少HBeAg 的分泌［11］。紅背葉根正丁醇提取物也可顯著降低HBeAg 分泌水平，治療指數(shù)＞67.1［14］。

從9 種中藥中提取出來的3 種物質(zhì)和7 種混合物能減少HepG2.2.15 細(xì)胞上清HBsAg 釋放，其治療指數(shù)也位居前十(表2)?？鄥A是從苦參分離出的主要生物堿，其通過脂質(zhì)體封裝形式在抑制HepG2.2.15 細(xì)胞HBV 表面抗原釋放方面有最高的治療指數(shù)。而且與自然苦參堿相比，在同一劑量下，脂質(zhì)體封裝形式對(duì)HepG2.2.15 細(xì)胞有更小的毒性［15］。在抑制HBsAg 分泌最強(qiáng)的10 種單味中藥中，漢黃芩素的IC50最低(4 μg/mL)。與拉米夫定相比，相同劑量的漢黃芩素能使HepG2.2.15 細(xì)胞分泌更少的HBsAg［11］。另一篇文獻(xiàn)中報(bào)道黃芩苷對(duì)HBeAg 抑制分泌的治療指數(shù)為65.22［16］。艾葉的乙酸乙酯提取物據(jù)報(bào)道也具有同樣的效應(yīng)［17］。

表2 抑制HBeAg 及HBsAg 分泌治療指數(shù)前十位的的單味中藥提取物

2.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中單味中藥提取物抗HBV 效應(yīng) 納入文獻(xiàn)中有26 篇檢測(cè)了感染鴨血漿中的DHBV DNA，用藥量從每日1 mg/kg 至每日10 000 mg/kg 不等，并進(jìn)行了分期為10 d至12 周的持續(xù)治療時(shí)間。在感染雛鴨實(shí)驗(yàn)中共研究了7 種中草藥，其中4 種對(duì)感染鴨血漿中的DHBV DNA 水平抑制率超過了50%。這4 種草藥是葉下珠、苦參、大黃、黃芩(表3)。研究發(fā)現(xiàn)葉下珠對(duì)感染鴨血漿中DNA水平抑制率取決于其來源及每天600 ～10 000 mg/kg 的用藥劑量變化［18-19］。與在HepG2.2.15 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上的研究結(jié)果一致，大黃水提取物能夠降低感染鴨肝細(xì)胞中DNA聚合酶的活性［20］，從黃芩中提取出來的漢黃芩素每天20 mg/kg 能抑制54%感染鴨的肝臟的閉合和線性形式的DNA復(fù)制［11］。山芝麻水提取物和丹參中的原兒茶醛也具有類似的效應(yīng)［21-23］。

表3 鴨肝炎模型血漿中對(duì)DHBV DNA 抑制率最高的前十種單味中藥提取物

3 討論

通過分析納入的122 篇文獻(xiàn)，總結(jié)了傳統(tǒng)中草藥在體內(nèi)外抗HBV 療效的實(shí)驗(yàn)研究。通過對(duì)文獻(xiàn)中治療指數(shù)等數(shù)據(jù)的提取和整理后發(fā)現(xiàn)從24 種中草藥提取的13 種物質(zhì)和11 種提取物的混合物具有較低細(xì)胞毒性同時(shí)可對(duì)細(xì)胞中HBV DNA、HBeAg 和HBsAg 的釋放產(chǎn)生強(qiáng)大的抑制效應(yīng)。24 種中的7 種中草藥用于感染DHBV 鴨模型的研究，從其提取出來的4 種成分對(duì)感染鴨模型血漿中DNA 水平的抑制作用超過了50%。而對(duì)治療指數(shù)排列前十位的中藥提取物抗HBV 活性的進(jìn)一步分析表明，抑制HBV DNA 合成效應(yīng)最小藥物有效質(zhì)量濃度為0.192 μg/mL (青蒿素)，最大有效質(zhì)量濃度為212.36 μg/mL (大黃乙醇提取物)，且大多數(shù)藥物效應(yīng)呈劑量依賴性，但均高于西藥拉米夫定的有效用藥質(zhì)量濃度(0.03 μg/mL)。而對(duì)HBeAg 和HBsAg 分泌抑制作用，葉下珠中提取的鞣花酸和丹參中提取的苦參堿治療指數(shù)分別為13 371.43 和93.46，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于拉米夫定(TI=1.16 和2.53)。以上結(jié)果提示與傳統(tǒng)西藥拉米夫定相比，單味中藥抑制HBV DNA 的療效較弱。但后者在抑制HBeAg 和HBsAg 分泌方面有較高的治療指數(shù)，可比拉米夫定更有效地減少這兩個(gè)抗原的分泌。

約82%的文獻(xiàn)中報(bào)道測(cè)量細(xì)胞上清中HBeAg 和HBsAg分泌量，而只有45 篇(49.45%)文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)量HBV DNA水平。然而，中草藥制劑可使細(xì)胞分泌的HBeAg 和HBsAg減少不一定是降低HBV DNA 復(fù)制的結(jié)果。在這些有高治療指數(shù)的藥物中，只有4 種提取物8-O-β-D-葡萄糖大黃素、青蒿素、皂苷和連翹苷在HBV DNA 釋放上表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。而除了前兩種，后兩種藥物在抑制HBeAg 和HBsAg 分泌上無明顯效應(yīng)。此外，鞣花酸能有效地減少HBeAg分泌水平，而對(duì)HBV DNA 復(fù)制沒有抑制作用。因此，建議中草藥體外抗HBV 效應(yīng)的研究應(yīng)包括HBV DNA 定量檢測(cè)。

在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)有抗HBV 效應(yīng)的單味中藥提取物中，乙醇提取物有8 種，水提取物有7 種，而正丁醇、甲醇和乙酸乙酯提取物各有1 種，此外均為分子構(gòu)象明確的化合物，如大黃中提取的8-O-β-D-葡萄糖苷大黃素和黃芩中提取的漢黃芩素等，屬于酮類、苷類或蒽醌類物質(zhì)。而這兩種物質(zhì)在對(duì)體內(nèi)HBV DNA、HBeAg 和HBsAg 的釋放均具有較高的治療指數(shù)。體內(nèi)研究也表明，二者可明顯地降低感染鴨血漿中的DNA 水平。而苦參中提取的苦參堿若采用脂質(zhì)體包裹的方法進(jìn)行改造，其抑制HBsAg 分泌和體內(nèi)DHBV 合成的效應(yīng)都會(huì)增加［24］。以上結(jié)果提示不同的中藥提取方法和成分組成對(duì)其抗HBV 的活性也有影響。

所有的納入文獻(xiàn)中均未明確提及單味中藥提取物抗HBV 合成和分泌HBeAg 和HBsAg 的作用機(jī)制及作用途徑。但有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示用西藥拉米夫定治療感染鴨模型，其血清中DHBV DNA 會(huì)反常性升高，而大多數(shù)中藥提取物在終止治療后抗HBV 活性效應(yīng)會(huì)持續(xù)存在。這大概與e 抗原和表面抗原參與了乙肝病毒的免疫應(yīng)答［25］有關(guān)。提示中草藥制劑不僅具有直接抗HBV 功能，也可以通過抑制乙肝病毒抗原來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)。

4 結(jié)論

越來越多的研究報(bào)道顯示，單味中藥提取物及提取物合成的化合物在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出較低的細(xì)胞毒性作用和抑制HBV DNA 合成及HBeAg 和HBsAg 分泌的作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也具有抗DHBV 活性的作用。其中丹參、大黃、苦參和黃芩這4 種草藥中提取出來的物質(zhì)和提取物組成的混合物的體內(nèi)外抗HBV 活性均已被證實(shí)，其在臨床試驗(yàn)中的頻繁使用表明，它們?cè)诳挂倚透窝撞《靖腥镜闹委熒暇哂袕V泛的治療價(jià)值。尤其是大黃中提取的8-O-β-D-葡萄糖苷大黃素和黃芩中提取的漢黃芩素，很可能成為抗HBV 新藥的候選者。本文通過對(duì)單味中藥體內(nèi)外抗HBV 活性的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢索和分析，以期提供更多關(guān)于探索和評(píng)價(jià)中草藥治療慢性乙型肝炎的效果以及中草藥對(duì)抗HBV 新視角的信息。

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