瑤藥落懂緊(金櫻子)根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

周小雷，王碩，2，樊溪源，龔小妹，3，袁經(jīng)權(quán)，4*

(1.廣西藥用植物研究所，廣西南寧530023;2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530021;3.廣西中醫(yī)學(xué)院，廣西南寧530001;4.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632)

瑤藥落懂緊［1］為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigataMichx的干燥根，性平、味酸澀，有固精澀腸作用。主治遺精、遺尿、痢疾泄瀉、崩漏帶下、子宮脫垂、痔瘡［2］，可用于治療燒燙傷［3］，止滑痢，煎醋服化骨哽［4］，現(xiàn)在已廣泛地被用于臨床。研究表明金櫻根含三萜皂苷［5］、黃酮［6］、鞣質(zhì)［7］等成分。現(xiàn)代藥理研究表明金櫻根有抗炎、止痛、止血、促進(jìn)腸蠕動(dòng)作用［8-11］，有耐缺氧作用［12］。是兩廣和湖南地區(qū)習(xí)用的大宗藥材，為四大著名傳統(tǒng)中藥三金片、金雞膠囊、婦科千金片、王老吉的主要成分，長(zhǎng)期以來一直強(qiáng)力支撐著我國(guó)重點(diǎn)中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。參考文獻(xiàn)［13］對(duì)其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，以便更有效控制該藥材。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LEICA生物顯微鏡(德國(guó)LaiLa)，電子分析天平(CP2250D，Sartorius)，SX2—4JOA箱式電阻爐(上海比爾得儀器實(shí)業(yè)有限公司)，210型高效色譜儀(UV325檢測(cè)器，410自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)瓦里安公司)，超純水儀(美國(guó)Millipore Milli-Q Academic)。

1.2 對(duì)照品金櫻根皂苷D、E對(duì)照品為自行制備。金櫻根皂苷D為白色晶體(三氯甲烷)，LCMS:m/z651［M+H+］，1H-NMR(600 MHz)δ:1.29，1.51(2H，m，H-1)，4.14(1H，m，H-2)，3.12(1H，dd，J=9.6，4.0 Hz，H-3)，1.12(1H，H-5)，1.84(2H，H-6)，1.80(2H，H-7)，1.70(1H，H-9)，2.01(2H，H-11)，5.17(1H，br.s，H-12)，1.78(2H，H-15)，1.22(2H，H-16)，2.51(1H，s，H-18)，1.31(1H，H-20)，1.24(2H，H-21)，1.75(2H，H-22)，1.09(3H，s，H-23)，0.65(3H，s，H-24)，0.85(3H，s，H-25)，0.72(3H，s，H-26)，0.86(3H，s，H-27)，1.22(3H，s，H-29)，0.81(3H，d，J=6.5 Hz，H-30)，5.27(1H，d，J=7.0，Hz，H-1')，3.28～3.32(1H，m，H-2')，3.30～3.33(1H，m，H-3')，3.32-3.37(1H，m，H-4')，3.37～3.43(1H，m，H-5')，3.47(1H，dd，J=12，4.3 Hz，H-6')，4.15(1H，dd，J=12，2.0 Hz，H-6')。13C-NMR(CD3OD，600 MHz)δ:42.8(C-1)，66.0(C-2)，79.0(C-3)，38.6(C-4)，48.4(C-5)，18.5(C-6)，33.4(C-7)，40.7(C-8)，47.6(C-9)，38.6(C-10)，24.1(C-11)，128.2(C-12)，139.1(C-13)，42.0(C-14)，29.3(C-15)，26.0(C-16)，48.4(C-17)，54.3(C-18)，72.5(C-19)，42.0(C-20)，26.9(C-21)，37.6(C-22)，29.0(C-23)，22.2(C-24)，16.7(C-25)，17.4(C-26)，24.5(C-27)，176.8(C-28)，26.7(C-29)，16.7(C-30)，95.6(C-1')，73.8(C-2')，78.7(C-3')，71.1(C-4')，79.0(C-5')，62.3(C-6')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］報(bào)道的2α，3α，19α-2，3，19-tridroxyurs-12-en-28-oic acid β-D-glucopyranosyl ester一致。

金櫻根皂苷E為白色晶體(三氯甲烷)，LCMS:m/z651［M+H+］，1H-NMR(600MHz)δ:1.49，1.60(2H，m，H-1)，4.10(1H，m，H-2)，2.52(1H，dd，J=11.4，4.3 Hz，H-3)，1.09(1H，H-5)，1.81(2H，H-6)，1.79(2H，H-7)，1.70(1H，H-9)，2.01(2H，H-11)，5.30(1H，br.s，H-12)，1.78(2H，H-15)，1.21(2H，H-16)，2.43(1H，s，H-18)，1.33(1H，H-20)，1.25(2H，H-21)，1.75(2H，H-22)，1.10(3H，s，H-23)，0.68(3H，s，H-24)，0.88(3H，s，H-25)，0.66(3H，s，H-26)，0.89(3H，s，H-27)，1.21(3H，s，H-29)，0.82(3H，d，J=6.5Hz，H-30)，5.31(1H，d，J=8.0 Hz，H-1')，3.28～3.32(1H，m，H-2')，3.30～3.33(1H，m，H-3')，3.32～3.37(1H，m，H-4')，3.37～3.43(1H，m，H-5')，3.65(1H，dd，J=12，4.3Hz，H-6')，3.80(1H，dd，J=12，2.0 Hz，H-6')。13C-NMR(CD3OD，600 MHz)δ:47.1(C-1)，68.2(C-2)，83.3(C-3)，40.0(C-4)，56.5(C-5)，20.3(C-6)，33.2(C-7)，40.0(C-8)，46.7(C-9)，38.4(C-10)，23.7(C-11)，128.4(C-12)，138.5(C-13)，41.6(C-14)，25.3(C-15)，26.0(C-16)，48.4(C-17)，53.8(C-18)，72.4(C-19)，41.7(C-20)，28.4(C-21)，37.0(C-22)，23.3(C-23)，16.3(C-24)，14.4(C-25)，15.4(C-26)，25.9(C-27)，177.3(C-28)，23.9(C-29)，15.4(C-30)，94.6(C-1')，72.7(C-2')，77.3(C-3')，69.9(C-4')，77.1(C-5')，61.2(C-6')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］報(bào)道的一致，為2α，3β，19α-2，3，19-tridroxyurs-12-en-28-oic acid β-D-glucopy ranosyl ester。經(jīng)HPLC面積-歸一化測(cè)定，化合物純度均為99%。

1.3 藥材與試劑11批金櫻根藥材采自廣西不同產(chǎn)地，經(jīng)馬小軍研究員鑒定為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigataMichx的根。甲醇(色譜純，美國(guó)Fisher公司)、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別取不同產(chǎn)地金櫻根藥材粉末2 g，分別加入80%的乙醇各50 mL，提取2次，每次超聲提取30 min，過濾，棄去濾渣，濾液減壓蒸干，用甲醇轉(zhuǎn)溶至10 mL量瓶中并定容，作為供試品溶液。另取金櫻根皂苷D、E對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄V B)試驗(yàn)，吸取不同產(chǎn)地供試品溶液各10 μL、對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)在同硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(5∶1∶1)為展開劑，以香草醛-硫酸液為顯色劑，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，主斑點(diǎn)顯相同深藍(lán)色的斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

圖1 瑤藥落懂緊(金櫻子)根藥材的TLC圖Fig.1 TLC chromatogram of Rosa laevigata Radix

2.2 浸出物采用冷浸法測(cè)定醇溶性浸出物，乙醇為95%，結(jié)果見表1。11個(gè)不同產(chǎn)地的樣品的水浸出物結(jié)果在8.73%～19.93%，平均13.68%，醇浸出物結(jié)果6.83%～18.99%，平均10.86%，暫定水浸出物不得少于8%，醇浸出物不得少于6%。

2.3 水分、灰分檢查以烘干法測(cè)定藥材的水分，灰分測(cè)定方法參照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅨK灰分測(cè)定法，結(jié)果見表1。

表1 各產(chǎn)地金櫻根水分、灰分及浸出物測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of moisture，ash and extract in Rosae laevigatae Radix

檢查結(jié)果顯示:11個(gè)不同產(chǎn)地的樣品的總灰分平均值為3.51%，酸不溶性灰分平均值為0.23%。水分平均為7.59%，暫定為總灰分不得過6%，酸不溶性灰分不得過2%，水分不得大于10%。

2.4 樣品測(cè)定

2.4.1 色譜條件Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為甲醇-乙腈(4∶1)，流動(dòng)相B為0.1%磷酸水，梯度洗脫(0～40 min，30%～80%A);檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為30℃，體積流量為0.6 mL/min。見圖2。

圖2 混合對(duì)照品(A)與金櫻根藥材供試品(B)的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram s of reference substances(A)and Rosae laevigatae Radix

2.4.2 供試品溶液的制備取金櫻根藥材粉末0.8g，精密稱定，按照2.1項(xiàng)下方法制備供試品，用色譜甲醇轉(zhuǎn)溶至10 mL量瓶中并定容，搖勻，以0.45 μm的微孔濾膜過濾即得。照2.4.1項(xiàng)條件進(jìn)行樣品分析，樣品中金櫻根皂苷D、E與其它組分能夠達(dá)到基線分離，與相鄰的色譜峰分離度大于1.5，結(jié)果見圖2。

2.4.3 線性關(guān)系的考察精密稱定金櫻根皂苷D對(duì)照品0.011 89 g、金櫻根皂苷E 0.011 61 g，用色譜甲醇溶解定容至刻度搖勻，配得混合對(duì)照品液體(其中金櫻根皂苷D質(zhì)量濃度為0.594 5 mg/mL、金櫻根皂苷E為0.580 5 mg/mL)，搖勻后以0.45 μm的濾液微孔濾膜過濾，自動(dòng)進(jìn)樣2、4、8、12、16、20 μL，按2.4.1項(xiàng)測(cè)定，以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸，得金櫻根皂苷D標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=10.101X－3.451(r=0.999 9)，金櫻根皂苷E為Y=8.539X－2.111(r=0.999 8)。金櫻根皂苷D、E分別在1.189 μg～11.890 μg、1.161 μg～11.610 μg之間時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積之間有良好的線性關(guān)系。

2.4.4 精密度考察取金櫻根皂苷D質(zhì)量濃度為0.594 5 mg/mL、金櫻根皂苷E質(zhì)量濃度為0.580 5 mg/mL的混標(biāo)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，按2.4.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果金櫻根皂苷D、E的峰面積RSD值分別為0.81%、0.71%。

2.4.5 穩(wěn)定性考察取金櫻根2號(hào)供試品液，于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣10 μL，按2.4.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果金櫻根皂苷D、E的峰面積RSD值分別為0.38%、0.27%，結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 重復(fù)性考察取金櫻根2號(hào)藥材粉末2 g，共6份，精密稱定，按2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，按2.4.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果金櫻根皂苷D、E的峰面積RSD值分別為0.87%、1.09%。

2.4.7 加樣回收率考察取已測(cè)定的金櫻根2號(hào)藥材粉末6份，各0.4 g，精密稱定，精密加入金櫻根皂苷D對(duì)照品1.922 mg/mL、金櫻根皂苷E對(duì)照品2.746 mg/mL各1 mL，按2.4.2項(xiàng)制備供試品溶液，微孔濾膜濾過，自動(dòng)進(jìn)樣10 μL，按2.4.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

2.4.8 樣品測(cè)定取供試樣品，過0.45 μm的微孔濾膜過濾，自動(dòng)進(jìn)樣，測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。結(jié)果表明:金櫻根皂苷D質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.042 0%～0.492 5%;金櫻根皂苷E質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.082 6%～0.696 0%，見表3，暫擬定“每克藥材金櫻根皂苷D不少于0.03%，金櫻根皂苷E不少于0.07%”。

表3 金櫻根藥材測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Contents of laevigatoside D and laevigatoside E in Rosae laevigatae Radix(n=3)

3 討論

金櫻根藥材中有效成分檢測(cè)指標(biāo)的缺失嚴(yán)重影響其藥材質(zhì)量，建立金櫻根中成分的定性定量的檢查方法對(duì)于保證金櫻根藥材的質(zhì)量具有重要意義。因此本實(shí)驗(yàn)制備了金櫻根藥材的對(duì)照品，并建立其薄層色譜檢識(shí)方法和高效液相色譜定量測(cè)定方法。

在前期的金櫻根化學(xué)成分研究中，發(fā)現(xiàn)金櫻根主要成分為皂苷和鞣質(zhì)，尤其皂苷類化合物在金櫻根中廣泛存在，是一類特征性成分，且具有多種生物活性。其中，金櫻根皂苷D(2α，3α，19α-2，3，19-tridroxyurs-12-en-28-oic acid β-D-glucopyranosyl ester)和金櫻根皂苷E(2α，3β，19α-2，3，19-tridroxyurs-12-en-28-oic acid β-D-glucopyranosyl ester)為異構(gòu)體皂苷，是金櫻根的主要皂苷類化合物。因此本研究選用了3種不同的提取溶劑乙醇、丙酮和乙酸乙酯對(duì)樣品進(jìn)行提取，以金櫻根皂苷D和金櫻根皂苷E的為考察指標(biāo)，HPLC測(cè)定結(jié)果表明，溶劑對(duì)提取效果影響較大，乙醇做提取劑對(duì)金櫻根皂苷D和金櫻根皂苷E的提取效果最好。對(duì)于供試品的制備過程中，對(duì)不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)、超聲時(shí)間進(jìn)行了比較，結(jié)果以80%的乙醇，超聲提取30 min，提取2次的效果最好，故采用本法制備供試品溶液。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過多次選擇條件，最后采用A相為甲醇-乙腈(4∶1)，B相為0.1%磷酸水，梯度洗脫(0～40 min，30%～80%A)。曾經(jīng)采用甲醇-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，但是所測(cè)得的金櫻根皂苷D和金櫻根皂苷E保留時(shí)間長(zhǎng)，峰型前沿且與前面的干擾峰達(dá)不到基線分離，選擇乙腈－0.1%磷酸水作為流動(dòng)相，梯度洗脫，但所測(cè)保留時(shí)間過短，干擾峰與金櫻根皂苷D、金櫻根皂苷E的分離度達(dá)不到測(cè)定要求。經(jīng)過甲醇與乙腈比例的調(diào)整，有機(jī)相和水相梯度的調(diào)整，最終達(dá)到干擾峰與金櫻根皂苷D、金櫻根皂苷E達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，金櫻根皂苷D和金櫻根皂苷E分離度大于1.5，且峰型對(duì)稱，理論塔板數(shù)高。

對(duì)所測(cè)樣品中金櫻根皂苷D、E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與樣品水浸出物和乙醇浸出物數(shù)值進(jìn)行比較，結(jié)果表明金櫻根皂苷D、E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與浸出物數(shù)值沒有相關(guān)性，金櫻根浸出物的數(shù)值高低可能與其中其他成分的高低有關(guān)。

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