響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花多糖羧甲基化工藝及抗氧化性研究

趙 鵬，張婷婷

陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，咸陽 712046

金銀花(Lonicera japonica)是忍冬科植物忍冬的干燥花蕊，其主要分布于我國的山東、河北、陜西等省。金銀花是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，主要具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱、抗病毒等功效，在臨床上可用于治療丹毒、喉痹、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒等疾病［1，2］。研究表明，金銀花多糖是金銀花中的主要活性成分之一，具有較好的抗氧化、抗菌、提高免疫力等生物活性［3-5］。目前對于金銀花多糖的研究主要集中其分離純化、藥理活性等方面［6-9］，而對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍生化方面的研究尚未見報道。

對于多糖進(jìn)行衍生化的方法主要包括物理法、化學(xué)法及生物法等。利用化學(xué)的方法對多糖的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，能夠提高其生物活性，甚至賦予其新的生物活性。正因為如此，對于多糖的衍生化研究已成為多糖研究者重點關(guān)注的熱點之一［10-13］。

本研究在前期對金銀花多糖分離純化的研究基礎(chǔ)之上，利用響應(yīng)面法對金銀花多糖羧甲基化修飾的合成工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，并初步研究了羧甲基化后多糖的抗氧化性，考察羧甲基化修飾對金銀花多糖抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花購自西安萬壽路中藥材批發(fā)市場，氯乙酸、異丙醇、乙醇、乙醚、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鄰苯三酚及其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-2501PC 紫外可見分光光度儀(日本島津公司);FA2004 電子天平(上海精科天平廠);H2050R臺式離心機(湖南湘儀公司);ALPHA1-4 型真空冷凍干燥機(德國CHRIST 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 金銀花多糖的制備

將金銀花在80 ℃下干燥，粉碎后過60 目篩。再將其用無水乙醇在回流下脫脂兩次，過濾，濾渣晾干后，用雙蒸水，按料液比1∶15(g/mL)80 ℃下提取2 次，提取液合并，再按1 g 生藥材濃縮為1mL 進(jìn)行濃縮，濃縮液經(jīng)脫蛋白、脫色處理后醇沉，即得金銀花粗多糖，用水復(fù)溶后，再用Sephadex G-200 凝膠柱進(jìn)行純化，收集多糖富集峰，濃縮后凍干即得金銀花多糖，經(jīng)測定該多糖含量為95.2%，經(jīng)高效凝膠色譜法檢測，其為均一多糖，分子為31.3 Ku。

1.2.2 金銀花多糖的羧甲基化

參照文獻(xiàn)的方法［10］，先精確稱取一定量的多糖樣品，加入適量異丙醇與濃度為20%的NaOH 的混合溶液將其溶解;再將氯乙酸溶于異丙醇中，并加入適量的20% NaOH 溶液混合均勻。在一定溫度下，往多糖溶液滴加一定量的氯乙酸的異丙醇溶液。滴加完畢后，恒溫反應(yīng)一段時間后，待反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，再用鹽酸溶液將反應(yīng)液調(diào)為中性。將反應(yīng)液裝入截留分子量為3500 的透析袋中用流動水透析48 h。透析液濃縮后即得羧甲基化修飾的金銀花多糖。

1.2.3 金銀花多糖羧甲基化取代度的測定

金銀花多糖羧甲基化取代度的計算均按文獻(xiàn)［13］的方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取10 mg 羧甲基多糖樣品，在100 ℃干燥1 h 后轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入3 mL 70%乙醇，混合后放置5 min。再依次加入10 mL水，50 mL 0.5mol/L NaOH?；旌虾髷嚢柚敝翗悠啡芙狻Ｈ缓笥?.1 mol/L 鹽酸滴定，用酚酞顯示點，計算每克羧甲基多糖所需的鹽酸的毫摩爾數(shù)(A):

式中:Vo為加入的Na0H 的體積(mL);V2為樣品測定所消耗HCl 的體積(mL);V1為空白測定所消耗HCl 的體積(mL);Mo為加入的NaOH 的濃度，本實驗中為0.5 mol/L;M 為測定所用HCl 的濃度，本實驗中為0.1 mol/L;W 為測定所用樣品的質(zhì)量(g)。

羧甲基取代度(DS)按下式計算:

1.2.4 羧甲基化金銀花多糖結(jié)構(gòu)初步分析

參照文獻(xiàn)［14］，分別通過高效凝膠色譜法，紅外光譜以及紫外光譜對金銀花多糖羧甲基化前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。

1.2.5 抗氧化性能測試

參照文獻(xiàn)［14］測試樣品對超氧陰離子和羥自由基的清除效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 金銀花多糖羧甲基化的合成

2.1.1 單因素分析

2.1.1.1 反應(yīng)溫度對金銀花多糖羧甲基化取代度的影響

采用0.1g 金銀花多糖，固定反應(yīng)時間為2.5 h，氯乙酸濃度為:3.0 mol/L，分別考察了40、50、60、70和80 ℃五個反應(yīng)溫度下的反應(yīng)過程，測定的不同產(chǎn)物的羧甲基化取代度，確定最優(yōu)的反應(yīng)溫度。反應(yīng)溫度對金銀花多糖羧甲基化取代度的影響結(jié)果見圖1(A)。

2.1.1.2 氯乙酸濃度對金銀花多糖羧甲基化取代度的影響

采用0.1 g 金銀花多糖，固定反應(yīng)時間為2.5 h，反應(yīng)溫度60 ℃，分別考察了2.0、2.5、3.0、3.5 和4.0 mol/L 五個氯乙酸濃度下的反應(yīng)過程，測定的不同產(chǎn)物的羧甲基化取代度，確定最優(yōu)的氯乙酸濃度。氯乙酸濃度對金銀花多糖羧甲基化取代度的影響結(jié)果見圖1(B)。

2.1.1.3 反應(yīng)時間對金銀花多糖羧甲基化取代度的影響

采用0.1 g 金銀花多糖，固定氯乙酸濃度為:3.0 mol/L，反應(yīng)溫度60 ℃，分別考察了1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 五個反應(yīng)時間下的反應(yīng)過程，測定的不同產(chǎn)物的羧甲基化取代度，確定最優(yōu)的反應(yīng)時間。反應(yīng)時間對金銀花多糖羧甲基化取代度的影響結(jié)果見圖1(C)。

由單因素的實驗結(jié)果可知，當(dāng)反應(yīng)溫度在40～60 ℃時，多糖羧甲基化取代度的值逐漸增大，當(dāng)?shù)?0 ℃達(dá)到最大，隨后隨著溫度的升高，取代度又出現(xiàn)了下降趨勢，從多糖的取代度及穩(wěn)定性考慮，確定最優(yōu)的反應(yīng)溫度為60 ℃左右;當(dāng)氯乙酸濃度在2.0～3.0 mol/L 時，多糖羧甲基化取代度的值快速增大，當(dāng)?shù)?.0 mol/L 左右時達(dá)到最大，隨后隨著配料比的增加，取代度趨于平緩，因此確定最優(yōu)的氯乙酸濃度為3.0 mol/L 左右;當(dāng)反應(yīng)時間為1.0～2.0 h時，多糖羧甲基化取代度的值快速增大，2.0～2.5 h時逐漸變緩，2.5 h 小時以上，又逐漸下降，從多糖的取代度及穩(wěn)定性考慮，因此確定最優(yōu)的反應(yīng)時間為2.5 h。

圖1 反應(yīng)溫度(A)、氯乙酸濃度(B)及反應(yīng)時間(C)對金銀花羧甲基化取代度的影響Fig.1 Effects of reaction temperature (A)，concentration of chloroacetic acid (B)and reaction time (C)on DS of L.japonica polysaccharides

2.1.2 金銀花多糖羧甲基化工藝條件優(yōu)化

本研究按照Box-Benhnken 的中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素實驗的基礎(chǔ)之上，以羧甲基取代度(DS)為響應(yīng)值，選取反應(yīng)溫度、氯乙酸的濃度和反應(yīng)時間等三個對反應(yīng)具有較大影響的單因素進(jìn)行響應(yīng)面實驗，來優(yōu)化金銀花多糖羧甲基化的工藝條件。實驗因素和水平設(shè)計如表1 所示，響應(yīng)面得到的實驗及分析結(jié)果如表2 和表3 所示。

表1 實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the designed experiment

表2 響應(yīng)面分析實驗方案及實驗結(jié)果Table 2 Design and testing results of RSM

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

采用Design-Expert 7.01 軟件對響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到的結(jié)果進(jìn)行分析研究，試驗結(jié)果見表2，按照各因素對試驗結(jié)果的影響進(jìn)行二次方程擬合，擬合得到下式:

由方差分析表3 的分析結(jié)果可以看出，回歸方程的F 值為106.98，P＜0.0001，且失擬誤差的P 值為0.0919，不顯著，這說明，利用響應(yīng)面法擬合得到的試驗?zāi)Ｐ蜆O顯著，按照擬合模型得到的回歸方程，考察其因變量與自變量之間的線性相關(guān)系數(shù)后發(fā)現(xiàn)，r=0.16/0.16=1.0000，這一點表明用該數(shù)學(xué)模型來評估各相關(guān)因素對金銀花多糖羧甲基化取代度的影響可信值較高。對表3 的方差分析結(jié)果可以看出，響應(yīng)面試驗組合的反應(yīng)溫度和氯乙酸濃度對金銀花多糖羧甲基化取代度的影響均極顯著，反應(yīng)時間為顯著影響因素，其中最大的是反應(yīng)溫度，其次是氯乙酸濃度，反應(yīng)時間的影響最小，在交互影響因素中，反應(yīng)溫度與氯乙酸濃度之間的交互影響為顯著影響因素。

2.1.3 響應(yīng)面圖分析

通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗分析可以得到相應(yīng)的響應(yīng)面圖，響應(yīng)面圖可以更加直觀的反映出各單因素對金銀花多糖羧甲基化取代度的影響結(jié)果以及各單因素之間交互影響的強弱關(guān)系。響應(yīng)面實驗得到的響應(yīng)面圖見圖2。

圖2 氯乙酸濃度和反應(yīng)溫度(A)、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度(B)及反應(yīng)時間和氯乙酸濃度(C)交互影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots showing the mutual effects of concentration of chloroacetic acid and reaction temperature (A)，reaction time and temperature (B)and reaction time and concentration of chloroacetic acid (C)on DS of L.japonica polysaccharides

從圖2 可以看出:反應(yīng)溫度對金銀花多糖羧甲基化的取代度的影響極為顯著，圖中可看出其繪制的曲線最為陡峭;氯乙酸濃度對羧甲基化的影響次之，而影響最小的則是反應(yīng)時間，相較于反應(yīng)溫度而言，其曲線較為平滑一些。通過響應(yīng)面法預(yù)測得到的回歸模型分析，可預(yù)測得到金銀花多糖羧甲基化的最優(yōu)合成工藝條件是:反應(yīng)溫度是61.7 ℃，氯乙酸濃度是3.225 mol/L，反應(yīng)時間是2.6 h，預(yù)測的工藝條件下，得到的羧甲基化多糖的取代度為0.792［14］。

2.1.4 驗證實驗

按照上述預(yù)測的結(jié)果，從實驗操作的可操作性考慮，微調(diào)上述工藝條件為:反應(yīng)溫度是60 ℃，配料比是3.2 mol/L，反應(yīng)時間是2.6 h，在微調(diào)后的羧甲基化修飾的工藝條件下，做3 次多糖羧甲基化平行試驗，得到的羧甲基化金銀花多糖取代度的平均值為0.793，實驗結(jié)果表明，通過回歸方程預(yù)測得到的工藝條件與實際操作工藝條件十分吻合。

2.2 羧甲基化金銀花多糖的初步結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 分子量測定

選擇色譜柱:ShodexOhPakSB-804HQ;流動相:高純水;流速:0.8 mL/min，柱溫:25 ℃;檢測器:示差折光檢測器;進(jìn)樣量:10 μL 的條件下，分別對羧甲基化前后的金銀花多糖進(jìn)行了分子量的比較測試，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 金銀花多糖(A)及羧甲基化金銀花多糖(B)的高效凝膠色譜圖Fig.3 HGPC chromatograms of L.japonica polysaccharides (A)and carboxymethyl L.japonica polysaccharides (B)

由圖3 可知，經(jīng)過羧甲基化后的金銀花多糖主峰位置與羧甲基化前出峰時間基本一致，這說明，羧甲基化金銀花多糖的分子量分布基本與金銀花多糖一致，但是羧甲基化后的多糖高效凝膠色譜圖上出現(xiàn)了較多的小雜峰，這應(yīng)該是在羧甲基化過程中造成了部分金銀花多糖的水解所致。

2.2.2 紅外光譜

分別將金銀花多糖、羧甲基化金銀花多糖和溴化鉀研磨壓片后，紅外光譜儀進(jìn)行測定。結(jié)果如圖4 所示。

圖4 金銀花多糖(A)及羧甲基化金銀花多糖(B)的紅外光譜圖Fig.4 IR spectra of L.japonica polysaccharides (A)and carboxymethyl L.japonica polysaccharides (B)

由圖4 可以看出，金銀花多糖與其羧甲基化產(chǎn)物在紅外譜圖上的出峰位置很相似，這說明羧甲基化修飾對多糖的骨架結(jié)構(gòu)沒有造成影響。其中羧甲基化金銀花多糖的紅外譜圖上出現(xiàn)了強度較大的1606 cm-1、1420cm-1和1333 cm-1信號峰，這些信號峰分別歸屬為COO-的對稱和非對稱伸縮振動峰，而譜圖中1027 cm-1為C-O-C 的對稱收縮振動峰，通過對這些特征吸收峰進(jìn)行歸屬，可以判斷本研究已經(jīng)成功對金銀花多糖進(jìn)行了羧甲基化改性，并且未改變多糖本身的大體結(jié)構(gòu)。

2.2.3 紫外光譜

圖5 金銀花多糖(A)及羧甲基化金銀花多糖(B)的紫外光譜圖Fig.5 UV spectra of L.japonica polysaccharides and carboxymethyl L.japonica polysaccharides (B)

由圖5 可知，羧甲基化前后的金銀花多糖在200～450 nm 的紫外光譜基本一致，這說明改性并沒有對多糖造成大的影響。

2.3 羧甲基化金銀花多糖的抗氧化活性

2.3.1 羥自由基的清除實驗

本研究分別考察了金銀花多糖羧甲基化修飾前后對羥自由基的清除作用，實驗結(jié)果見圖6。

圖6 羥自由基的清除實驗Fig.6 The hydroxyl radical scavenging results

由圖6 可知，經(jīng)過羧甲基化修飾后的金銀花多糖清除羥自由基的最大清除率為88.3%，比羧甲基化前多糖的最大清除率60.2%提高了28.1%，清除羥自由基的能力有了明顯的提高。

2.3.2 超氧陰離子的清除實驗

本研究分別考察了金銀花多糖羧甲基化修飾前后對超氧陰離子的清除作用，實驗結(jié)果見圖7。

圖7 超氧陰離子的清除實驗Fig.7 The superoxide anion scavenging results

由圖7 可知，經(jīng)過羧甲基化修飾后的金銀花多糖清除超氧陰離子的最大清除率為96.32%，比羧甲基化前多糖的最大清除率80.2% 提高了16.12%，清除超氧陰離子的能力也有了明顯的提高。

上述抗氧化性實驗結(jié)果說明，羧甲基化修飾的金銀花多糖，其親水性發(fā)生了改變，這可能是使其抗氧化活性高于未修飾多糖的原因尚在進(jìn)一步的研究之中。

3 結(jié)論

本研究對金銀花多糖進(jìn)行羧甲基化修飾的工藝路線進(jìn)行研究，并通過響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了其最優(yōu)的修飾工藝條件是:反應(yīng)溫度是60 ℃，配料比是3.2 mol/L，反應(yīng)時間是2.6 h，在此條件下修飾制得的羧甲基化金銀花多糖的羧甲基化取代度為0.793，利用該方法對多糖進(jìn)行羧甲基化修飾，具有反應(yīng)可操作性強，試劑便宜易得，多糖的羧甲基化取代度較高的優(yōu)點，是一種較理想的多糖羧甲基化修飾方法。通過金銀花多糖羧甲基化衍生物超氧陰離子和羥自由基的清除實驗表明，經(jīng)過羧甲基化修飾后的抗氧化能力較之羧甲基化修飾前的多糖有了非常明顯的改善，其抗氧化能力進(jìn)一步增強，本研究的成果為金銀花多糖在藥品、功能性食品等領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

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