栝樓果皮中腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸動態(tài)積累規(guī)律研究

于京平，張永清，林海燕，林 鶯

1濱州醫(yī)學(xué)院，煙臺 264003;2山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南 250355

栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.為葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物，其干燥成熟果皮是常用中藥瓜蔞皮，可清熱化痰、利氣寬胸，具有抗心律失常、擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量等藥理作用;臨床常用于治療肺熱咳嗽、痰濁黃稠、胸痹心痛、肺癰等［1］。

有關(guān)瓜蔞皮的活性成分至今不明確，現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》僅收載了以對照藥材薄層定性的鑒別方法，控制瓜蔞皮藥材質(zhì)量尚缺乏合理指標［1］。以瓜蔞皮為原料研制生產(chǎn)的瓜蔞皮注射液可行氣除滿、開胸除痹，用于治療痰濁阻絡(luò)之冠心病、穩(wěn)定型心絞痛等。我們研究發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤［2］、鳥嘌呤核苷［2］、瓜氨酸是瓜蔞皮注射液中存在的主要成分之一?，F(xiàn)代研究顯示，腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸均具有明顯的藥理活性。腺嘌呤可提高紅細胞攜氧和放氧能力，與磷酸的結(jié)合物可刺激白細胞增生，用于防治白細胞減少癥［3］;鳥苷可改善心腦血液循環(huán)，具有防止心率失常、抗腫瘤、抗病毒等活性［4］。瓜氨酸在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為人體必需氨基酸:L-精氨酸，在維持心血管正常功能的一氧化氮代謝中發(fā)揮著重要作用［5］。因此，在活性成分尚不明確的情況下，可以將腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸作為瓜蔞皮藥材質(zhì)量的控制指標。

中藥材采收期對保證中藥材質(zhì)量有重要意義，若采收期適宜，則可保證中藥材中的藥用部分產(chǎn)量和有效成分含量都達到較高水平。目前，有關(guān)采收時間對瓜蔞皮藥材質(zhì)量的影響等方面的研究幾乎為空白。本文在統(tǒng)一種質(zhì)的前提下，選取腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸等化學(xué)成分作為指標，對栝樓果皮不同生長期化學(xué)成分的動態(tài)積累進行分析，為確定瓜蔞皮藥材的適宜采收期提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國Agilent);超聲儀(KQ-200，昆山市超聲儀器有限公司);數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070MBE，上海博訊公司);電子天平(FA1104，上海天平儀器廠)。

1.2 瓜蔞皮藥材

所用材料采自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定，確認為葫蘆科栝樓屬植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.。自7月3 日幼果期，在健壯枝條的中段選擇花后發(fā)育天數(shù)相同的栝樓幼果，掛牌標記。自7 月3 日幼果期到10 月26 日果實成熟期共采樣11 次，采樣時間統(tǒng)一定在晴朗的上午8∶00 時左右。不同生長期栝樓果皮的采收時間及外觀性狀見表1。

表1 不同生長期栝樓果皮的外觀性狀Table 1 The morphologic characteristics of T.kirilowii peel from different growth periods

1.3 試劑

對照品:腺嘌呤(批號050302，上海伯奧生物科技有限公司)、鳥苷(批號26-2006，上海中藥標準化中心)，瓜氨酸(批號0875-200205，中國藥品生物制品檢定所)，經(jīng)HPLC-UV 檢測純度均達98%以上;鄰苯二甲醛(色譜級，阿拉丁試劑上海有限公司);一氯甲酸芴甲酯(色譜級，阿拉丁試劑上海有限公司);乙腈(色譜級，Tedia，美國);甲醇(色譜級，Tedia，美國);純凈水。

2 實驗方法

2.1 核苷類成分的測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Waters Atlantis T3(5 μm，4.6 mm×150 mm);流動相:水(A)-甲醇(B);柱溫為室溫;檢測波長:254 nm;進樣量:50 μL。流動相梯度洗脫程序:0～15 min，100%A;15～35 min，100%～90%A;35～60 min，90%～70%A。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取一定量減壓干燥至恒重的鳥苷、腺嘌呤對照品，加15%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至20 mL 容量瓶中，定容，混勻，配制成腺嘌呤濃度為0.0310 mg/mL、鳥苷濃度為0.0704 mg/mL 的對照品溶液;以0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液備用。

2.1.3 樣品溶液制備

將瓜蔞皮置于55 ℃條件下烘干，粉碎，過四號篩。四分法取樣，精密稱定適量干燥粉末，置具塞瓶中，加15%甲醇10 mL，稱重;50 ℃溫浸1 h，50 ℃超聲提取1 h，冷卻，用15%甲醇補足重量，離心10 min(4500 rpm)，取上清液，重復(fù)提取2 次，合并上清液，用0.45 μm 濾膜濾過，即得。

2.1.4 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與樣品溶液50 μL，按上述色譜條件測定其峰面積積分值，以外標法計算樣品溶液中的鳥苷、腺嘌呤含量，重復(fù)3 次。

2.1.5 線性關(guān)系考察及標準曲線

制備腺嘌呤、鳥苷對照品系列濃度溶液，分別精密吸取50 μL 進樣，按2.1.1 項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(Y)，以對照品實際進樣量(mg)為橫坐標(X)，繪制標準曲線，腺嘌呤Y=8800000X-7.2062(R2=1)，鳥苷Y=3500000X +6.8633(R2=1)，見圖1。

圖1 對照品(1)與供試液(2)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the reference substance (1)and sample (2)

2.2 瓜氨酸的測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250.0 mm，5 μm);流動相:取醋酸鈉10.88 g，加水4000 mL 使溶解，加三乙胺0.8 mL，四氫呋喃24 mL，混勻，用2%冰醋酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.20，即得流動相A;取醋酸鈉10.88 g，加水800 mL 使溶解，用2%冰醋酸溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.20，加乙腈1400 mL，甲醇1800 mL，混勻，即得流動相B。柱溫:25 ℃;檢測波長:338 nm;進樣量:50 μL?？焖僦把苌磻?yīng):供試品和對照品溶液在pH10.2 的硼酸緩沖液中首先和1%鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)，再用0.5%一氯甲酸芴甲酯(FMOC)溶液進行衍生。

表2 流動相梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱取一定量減壓干燥至恒重的瓜氨酸對照品，加水溶解，轉(zhuǎn)移至20 mL 容量瓶中定容，混勻，配制成濃度為0.368 mg/mL 對照品溶液;以0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.3 樣品溶液制備

精密稱定適量干燥粉末，置具塞瓶中，加水10 mL，稱重;50 ℃溫浸1 h，50 ℃超聲提取1 h，冷卻，用水補足重量，離心10 min(4500 rpm)，取上清液，重復(fù)提取2 次，合并上清液，用0.45 μm 濾膜濾過，即得。

2.2.4 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與樣品溶液50 μL，按上述色譜條件測定其峰面積積分值，以外標法計算樣品溶液中的瓜氨酸含量，重復(fù)3 次。

2.2.5 線性關(guān)系考察及標準曲線

制備瓜氨酸對照品系列濃度溶液，分別精密吸取50 μL 進樣，按2.2.1 項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(Y)，以對照品實際進樣量(mg)為橫坐標(X)，繪制瓜氨酸標準曲線，Y=2000000X-1.3675(R2=1)，見圖2。

2.3.1 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，按2.1.1、2.2.1 項下色譜條件，測定腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸峰面積，重復(fù)5

圖2 對照品(1)與供試液(2)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the reference substance (1)and sample (2)

2.3 方法學(xué)考察次，其峰面積RSD 分別為1.17%、

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

精密吸取樣品溶液，在10 h 內(nèi)測定腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸峰面積5 次，其峰面積RSD 值分別為2.12%、1.12%、1.00%，表明樣品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗

精密稱取藥材粉末，分別按照2.1.3、2.2.3 項下方法同時制備5 份，分別測定腺嘌呤、鳥苷、瓜氨酸含量，其RSD 均小于5%，表明重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗

精密稱量已知鳥苷、腺嘌呤、瓜氨酸含量的樣品1.000 g，共6 份，分別加入一定量的對照品，分別按照2.1.3、2.2.3 項下方法制備，按2.1.1、2.2.1 項下色譜條件測定鳥苷、腺嘌呤、瓜氨酸含量，按回收率=(C-A)/B ×100%(A 為樣品中所含被測成分量;B 為加入對照品量;C 為實測值)計算回收率，結(jié)果鳥苷、腺嘌呤、瓜氨酸對照品回收率均值分別為101.20%、100.67%、100.15%，其RSD 分別為1.63%、1.91%，1.70%，表明鳥苷、腺嘌呤、瓜氨酸對照品回收率符合要求。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同生長期栝樓果皮鳥苷、腺嘌呤含量的測定及比較

對栝樓果皮生長發(fā)育過程中鳥苷、腺嘌呤含量進行動態(tài)測量，變化情況動態(tài)如圖3。

由圖3 可以看出，生長發(fā)育前期腺嘌呤、鳥嘌呤核苷含量總體呈下降趨勢，9 月中旬果實體積、重量基本達到最大時，兩者含量達到最低點;之后腺嘌呤、鳥苷快速積累，至果皮表面顏色稍微泛黃時，腺嘌呤含量達到最高值0.1893 mg/g，至果皮表面顏色基本全黃、僅維管束凸起處為綠色時鳥苷含量達到最高值0.4128 mg/g;隨著果實進一步成熟，兩者含量均出現(xiàn)下降，表現(xiàn)出隨著果實成熟度增加而下降的變化趨勢。

圖3 不同生長期栝樓果皮腺嘌呤、鳥苷含量的變化Fig.3 The contents of adenine and guanine nucleoside in T.kirilowii peel from different growth periods

圖4 不同生長期栝樓果皮瓜氨酸含量的變化Fig.4 The contents of citrulline in T.kirilowii peel from different growth periods

3.2 不同生長期栝樓果皮瓜氨酸含量的測定及比較

對栝樓果皮生長發(fā)育過程中瓜氨酸含量進行動態(tài)測量，變化情況動態(tài)如圖4。

由圖4 可以看出，瓜氨酸含量短暫升高之后平穩(wěn)降低，8 月17 日達到最低僅為0.4492 mg/g，之后呈現(xiàn)逐漸升高，至果皮顏色基本為黃色僅維管束凸起部分為綠色，此時瓜氨酸含量達到最高值12.8834 mg/g，隨著果實進一步成熟至果皮表面顏色基本全黃含量下降，至栝樓果實完全成熟果皮表面皺縮時含量稍微上升。

4 討論與小結(jié)

4.1 栝樓果實生長動態(tài)

栝樓果實從形成到成熟呈現(xiàn)出生長動態(tài)規(guī)律變化，經(jīng)歷果實重量、果實體積、果實長、果實直徑的增大、果實變軟、果皮顏色變化等一系列變化。9 月26日果皮顏色稍微泛黃標志著栝樓果實進入轉(zhuǎn)色期。

4.2 栝樓果皮生長過程中化學(xué)物質(zhì)積累動態(tài)

我們系統(tǒng)研究栝樓果皮整個生長周期多種化學(xué)成分含量變化規(guī)律，進一步探討栝樓果皮化學(xué)物質(zhì)積累與生長發(fā)育的關(guān)系。果皮中腺嘌呤含量在果皮顏色微黃時達到最高;鳥苷、瓜氨酸含量在果皮顏色基本全黃僅維管束凸起處為綠色時達到最高;總的來說未完全成熟的栝樓果皮中的化學(xué)物質(zhì)含量高于完全成熟的栝樓果皮，多種化學(xué)成分含量變化與果皮顏色轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。

4.3 采收期的確定

采收是藥材生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié)，直接影響著瓜蔞皮藥材的質(zhì)量與產(chǎn)量，中藥材的采收應(yīng)綜合考慮有效成分含量和產(chǎn)量的動態(tài)變化，最大限度保證中藥材中的藥用部分產(chǎn)量和有效成分含量均達到較高水平。針對栝樓果皮采收期沒有明確記載，傳統(tǒng)采收期多以栝樓果實為目標產(chǎn)物。栝樓果皮采收期與有效成分的動態(tài)累積有何內(nèi)在關(guān)聯(lián)，亦未見系統(tǒng)研究報道。結(jié)合實驗結(jié)果我們認為果皮顏色未轉(zhuǎn)黃之前是栝樓果皮生長和積累的重要時期，不宜采收;栝樓果皮應(yīng)于10 月初果實尚未完全成熟時、果皮表面顏色基本為黃色僅維管束凸起處為綠色時采摘，此階段栝樓果皮多種化學(xué)成分含量均達到最高峰;不宜過遲，否則果實老熟，皮薄，產(chǎn)量質(zhì)量均下降。

不同采收時間瓜蔞皮藥材質(zhì)量有明顯差異，獲得高產(chǎn)質(zhì)優(yōu)的瓜蔞皮藥材，需要精確到距離開花后的具體天數(shù)，之前提到由于其開花結(jié)果時間不一致，精確開花后的具體天數(shù)實踐操作復(fù)雜;但通過果皮顏色變化藥農(nóng)就可以準確快速判斷最佳采收時間，獲得高產(chǎn)質(zhì)優(yōu)的瓜蔞皮藥材，生產(chǎn)上直觀性強。另外在采收時我們可以做到分批選擇性采收，有效降低采收難度。

綜上所述，栝樓為多年生藤本植物開花掛果持續(xù)時間長，目前栝樓果皮發(fā)育過程中化學(xué)物質(zhì)積累規(guī)律等方面的研究尚為空白。栝樓果皮在發(fā)育和成熟過程中發(fā)生了很多結(jié)構(gòu)和代謝上的變化，我們通過了解各種化學(xué)物質(zhì)在栝樓果皮生長發(fā)育過程中的積累規(guī)律，探索栝樓果皮品質(zhì)的形成規(guī)律，提示我們通過制定合理的栽培措施調(diào)控其化學(xué)物質(zhì)含量具有可行性。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，52.

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