土壤來源鏈霉菌KIB-H91 次級代謝產(chǎn)物的分離鑒定

喻明明，蘇 燦，馬亞團，顏一軍，黃勝雄*，薛大權

1 湖北中醫(yī)藥大學中藥資源與中藥復方教育部重點實驗室，武漢 430065;2中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明 650201

微生物次級代謝產(chǎn)物是天然產(chǎn)物研究的重要組成部分，不僅因為其龐大的數(shù)量和結構的多樣性，更因為其中許多化合物都具有一定的生物活性。據(jù)統(tǒng)計，天然產(chǎn)物總量一半左右來源于微生物，且抗生素中約70%的化合物由放線菌產(chǎn)生［1］。雖然近年來由于抗生素耐受問題的出現(xiàn)，抗生素藥物的研發(fā)趨向于停滯，但是市場對于新穎抗菌藥物尤其是抑制革蘭氏陰性菌藥物的需求仍然極為迫切［2］。天然產(chǎn)物家族中，醌類化合物大多具有抗氧化和抗腫瘤活性。迄今為止，已經(jīng)上市的醌類藥物有絲裂霉素、艾地苯醌、塞曲司特等。其中絲裂霉素就是一種由頭狀鏈霉菌分泌的抗生素，一直以來被用于胃癌、肝癌、胰腺癌等癌癥的治療［3］。

本研究從云南昆明植物園采集的土壤樣本中分離得到一株鏈霉菌，命名為Streptomyces sp.KIBH91。在前期的發(fā)酵液活性篩選實驗中，我們發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液提取物有明顯的抑菌活性。因此，我們選取該菌株進行大量發(fā)酵并對發(fā)酵液中的次級代謝產(chǎn)物進行提取分離，最終得到了4 個主要化合物。通過分析其理化性質和波譜數(shù)據(jù)，分別將其鑒定為endocrocin(1)、laccaic acid D(2)、sarubicin A(3)和sarubicin B(4)(見圖1)，其中化合物3 和4 顯示較好的抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

圖1 化合物1～4 的化學結構Fig.1 Chemical structures of compounds 1-4

Bruker AvanceIII-600 MHz 型核磁共振儀;Bruker AV-400 型核磁共振儀;Waters Xevo TQ-S 型超高壓液相三重四極桿聯(lián)用質譜儀;XRC-1 型熔點儀(四川大學科學儀器廠生產(chǎn));LC3000 型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司生產(chǎn));Hitachi Chromaster 5430 型高效液相色譜儀;YMC-Triat C18型液相色譜柱(250×10 mm I.D.);柱層析硅膠G，200～300 目(青島海洋化工廠生產(chǎn));柱層析硅膠RP18，230～400 目(德國EMD 化學試劑公司生產(chǎn));其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 發(fā)酵菌株

發(fā)酵菌株Streptomyces sp.KIB-H91 為從昆明植物園(東經(jīng)102°45'，北緯25°9')采集的土壤樣本中分離得到，通過16S RNA 測序分析，確定其為鏈霉屬(經(jīng)比對與已知鏈霉菌Streptomyces lienomycini HBUM174506 相似性為100%)。菌株保存在昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

固體培養(yǎng)基:為MS 培養(yǎng)基，配方為大豆粉20 g/L(煮沸過濾取濾液)，甘露醇20 g/L，技術瓊脂粉20 g/L，pH=7.0。

種子培養(yǎng)基:為TSB 培養(yǎng)基，配方為胰蛋白胨17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，右旋葡萄糖2.5 g/L，pH=7.3±0.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆蛋白胨6 g/L，右旋葡萄糖5 g/L，可溶性淀粉20 g/L，碳酸鈣2 g/L，pH=7.0。

將在MS 平板上活化好的菌株接種到20 只裝有50 mL 種子液的250 mL 三角瓶中，置于27 ℃，250 rpm 搖床上培養(yǎng)2 d。

將種子液按10%接種量轉接到40 只盛有250 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的1 L 三角瓶中，置于27 ℃，250 rpm 搖床上培養(yǎng)5 d。

1.4 提取與分離

將發(fā)酵液收集，于6000 rpm 轉速下離心20 min。上清液用等體積的乙酸乙酯萃取三次;菌絲體用500 mL 丙酮浸泡過夜后過濾。合并乙酸乙酯與丙酮相，用無水硫酸鈉干燥，有機相減壓濃縮，得到3.1 g 粗提物。粗提物經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(100∶0，50∶50，0∶100)及乙酸乙酯-甲醇(50∶50)梯度洗脫，共得到4 個組分(F1～F4)。用HPLC 分析極性段F2 的成分(見圖2)，分析方法為:10%～100%甲醇-水梯度洗脫20 min，第21～25 min 再用100%甲醇等度洗脫，之后用10%甲醇-水等度洗脫3 min 結束;柱溫箱恒定在28 ℃，檢測器為DAD 檢測器。F2 經(jīng)反相硅膠柱層析，用甲醇-水(20∶80，40∶60，60∶40，80∶20，100∶0)梯度洗脫，得到5 個極性段(F2-1～F2-5)。其中F2-3 經(jīng)高效液相色譜制備，用18%甲醇-水等度洗脫，得到兩個化合物，分別是1(6.1 mg)和3(11.8 mg)。F2-4 也用HPLC 制備，以30%甲醇-水為流動相，洗脫得到化合物2(4.9 mg)和4(5.5 mg)。

圖2 極性段F2 的高效液相色譜分析結果Fig.2 HPLC chromatogram of F2 fraction

1.5 抗菌敏感性試驗

按照美國臨床與實驗室標準研究所(CLSI)出版的有關規(guī)程操作［4］，采用微量稀釋法測定化合物1～4 對大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 8099)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)和斜臥青霉(Penicillium decumbens ATCC 10436)四種病原菌的最小抑制濃度(MIC)。試驗中，每個化合物分別配制成800、400、200、100、50、25、12.5、6.25(μg/mL)八個稀釋濃度，并以制霉菌素為陽性對照，加入等體積50% DMSO-無菌水的孔為陰性對照，不接菌懸液的孔為空白對照。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

化合物1 黃色粉末;分子式為C16H10O7;ESIMS m/z:313［M-H］-;1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:13.12(1H，s，1-OH)，11.12(1H，brs，COOH)，7.56(1H，s，H-4)，7.03(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，6.55(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，2.56(3H，s，ArCH3);13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ:188.9(C-9)，182.1(C-10)，168.3(COOH)，165.6(C-6)，165.2(C-8)，158.2(C-1)，143.1(C-3)，135.1(C-4a)，133.1(C-10a)，130.4(C-2)，121.5(C-4)，113.2(C-9a)，110.3(C-8a)，109.4(C-5)，108.2(C-7)，19.8(ArCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［5］，確定化合物1 為endocrocin。

化合物2 紅褐色粘稠固體;分子式為C16H10O7;ESI-MS m/z:313［M-H］-;1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:13.57(1H，s，8-OH)，10.95(1H，brs，COOH)，7.26(1H，s，H-4)，7.12(1H，brs，6-OH)，7.01(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，6.56(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，3.01(3H，s，ArCH3);13C NMR(DMSOd6，150 MHz)δ:188.1(C-9)，183.0(C-10)，169.6(COOH)，169.5(C-3)，164.4(C-6)，163.5(C-8)，148.3(C-1)，136.2(C-10a)，134.2(C-4a)，125.3(C-2)，119.6(C-9a)，114.9(C-4)，110.9(C-8a)，108.5(C-7)，106.4(C-5)，20.5(ArCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［6］，確定化合物2 為laccaic acid D。

化合物3 紅色針晶(CH3OH);mp.196～199℃;分子式為C13H14N2O6;ESI-MS m/z:293［MH］-;1H NMR(methanol-d4，400 MHz)δ:4.93(1H，t，J=3.6 Hz，H-8)，3.82(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，3.63(1H，q，J=6.4 Hz，H-10)，2.60 and 1.34(each 1H，m，H2-7)，0.96(3H，d，J=6.4 Hz，H-11);13C NMR(methanol-d4，100 MHz)δ:204.1(C-10)，180.4(C-1 and C-4)，170.3(C-9)，155.1(C-3)，142.8(C-5)，135.7(C-7)，133.9(C-8a)，129.3(C-6)，127.2(C-8)，126.3(C-4a)，99.7(C-2)，30.6(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［7］，確定化合物3 為sarubicin A。

化合物4 黃色針晶(CH3OH);mp.284～285℃;分子式為C13H10N2O4;ESI-MS m/z:257［MH］-;1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:10.82(1H，s，3-NHa)，9.08(1H，s，CONHa)，8.31(1H，s，3-NHb)，8.16(1H，dd，J=4.2，6.0 Hz，H-8)，7.93(1H，t，J=6.0 Hz，H-7)，7.56(1H，overlapped，H-5)，7.56(1H，overlapped，CONHb)，2.44(3H，s，H3-11);13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ:182.6(C-1)，180.2(C-4)，172.3(C-9)，155.3(C-3)，149.2(C-4a)，135.6(C-8a)，99.0(C-2)，79.8(C-5)，73.6(C-10)，72.2(C-6)，63.5(C-8)，37.6(C-7)，17.1(C-11)。其1H 核磁數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致［8］，且HMBC 相關信號(見表1)也驗證了化合物4 的結構為sarubicin B。

表1 化合物3 和4 的核磁信號歸屬Table 1 1H and13C NMR data of compounds 3 and 4

2.2 化合物抗菌活性

抗菌敏感性試驗結果顯示，4 個化合物均對金黃色葡萄球菌和斜臥青霉沒有抑制作用;化合物3對大腸桿菌ATCC 8099 的MIC 值為25 μg/mL，化合物4 對枯草芽孢桿菌ATCC 6633 的MIC 值為12.5 μg/mL，表現(xiàn)出很好的抑菌效果(見表2)。

表2 化合物1～4 的抗菌活性Table 2 The antimicrobial activities of compounds 1-4

3 討論

本文分離得到的4 個代謝產(chǎn)物中，化合物2 是最初從紫梗原蟲膠中分離的一種色素［9］，其后在植物及真菌中均有發(fā)現(xiàn)，但其正確核磁數(shù)據(jù)直到2006年才由Usama 等人給出［6］。我們對其HSQC 和HMBC 解析的結果，也與Usama 等人報道的結構一致?；衔? 由Eckardt 等人在1982 年首次分離，但一直未有碳譜和二維核磁數(shù)據(jù)的報道［10］。通過初步的抗菌敏感性試驗，我們發(fā)現(xiàn)化合物3 和4 是鏈霉菌Streptomyces sp.KIB-H91 次級代謝產(chǎn)物中的主要活性物質。這兩個化合物都具有一個3-氨基-1，4-苯醌-2-甲酰胺單元，在天然抗生素中結構十分獨特。從生源途徑看，可以認為sarubicin B(4)是由sarubicin A(3)脫去兩分子水得來。我們首次從同一株鏈霉菌中分離得到這兩個化合物，也從側面驗證了它們在生物合成上的聯(lián)系。

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