不同產(chǎn)地生姜主要活性成分的比較分析

劉琳琪，劉玉環(huán)，趙晨曦，王小梅，王麗平，彭霞輝

長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程系，長沙 410022

生姜屬于姜科多年生草本植物的嫩根莖［1］，具有調(diào)味、保鮮、防腐、抗氧化、止吐［2］等作用。生姜中的化學(xué)成分主要包括姜辣素、姜精油和二苯基庚烷三類［3］。姜辣素是生姜中的辛辣成分，根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可分為姜酚、姜酮、姜烯酚等類型，其中姜酚類和姜酮類物質(zhì)是生姜發(fā)揮藥理作用的主要活性成分［4］。姜酚類有6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚和10-姜酚等，每100 g 干姜中其含量分別在4.74～5.59 mg、1.41～1.85 mg、0.34～0.75 mg 和0.05～0.18 mg 之間，其中6-姜酚的含量和生物活性最高［5］，具有抗氧化［6］、抗腫瘤［7］、抑菌［8］、保肝［9］、抑制細(xì)胞衰老［10］等藥用價(jià)值。因此，6-姜酚可作為評(píng)價(jià)生姜及藥物品質(zhì)的的一項(xiàng)客觀指標(biāo)［11］?！吨袊幍洹芬徊?010 版規(guī)定6-姜辣素(即6-姜酚)為生姜的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)成分［1］。生姜揮發(fā)油含量在1%～3%，具有特殊香氣，主要化學(xué)成分是單萜和倍半萜類化合物［12］。姜精油中的倍半萜類和單萜類物質(zhì)的含氧衍生物有較強(qiáng)的生物活性，具有良好的抗菌［13］、抗氧化［14］、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮［2］等作用。

由前所述，6-姜酚是生姜發(fā)揮藥理作用的主要成分，而揮發(fā)油同樣具有較為顯著的藥理作用?，F(xiàn)行中國藥典規(guī)定6-姜辣素為生姜質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分，有失全面和科學(xué)性。然而目前尚未見將6-姜辣素與姜精油中主要活性成分共同作為生姜質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的文獻(xiàn)報(bào)道。故本研究同時(shí)分析了不同產(chǎn)地姜精油的成分及6-姜辣素含量，擬將生姜主要特征性活性成分姜烯、姜黃烯及6-姜辣素共同作為其質(zhì)量控制指標(biāo)成分，這樣可以更加全面的評(píng)價(jià)生姜的質(zhì)量，為完善藥典單一的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品和對(duì)照品

實(shí)驗(yàn)樣品:新鮮生姜樣品由9 個(gè)不同地區(qū)(長沙、攸縣、河南、湖北、岳陽、山東、郴州、婁底、唐山)的學(xué)生于2014 年2 月21、22 日兩天在其居住地購買后帶來實(shí)驗(yàn)室，依次編號(hào)為1～9 號(hào)，每種生姜樣品500 克洗凈后于40oC 烘干表面水分備用。

對(duì)照品:6-姜酚。購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)，20 mg/支，含量＞98%，批號(hào)為MUST-13012303。

1.1.2 主要試劑

甲醇(色譜純，天津市彪仕科技發(fā)展有限公司)、磷酸(色譜純，長沙市湘科精細(xì)化工廠)、乙腈(色譜純，天津市賽孚瑞科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器

高效液相色譜裝置(LC-20AD，島津公司)、電子分析天平(AUY120，島津公司)、GC-MS 儀(6890/5973 型，安捷倫公司)、超聲波清洗器(KH-500V 型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、水蒸氣蒸餾裝置。

1.2 揮發(fā)油的提取

本實(shí)驗(yàn)采用現(xiàn)行藥典中水蒸氣蒸餾法提取生姜的揮發(fā)油。選取無腐爛、無霉變的生姜。稱取生姜200 g，切成碎末，置于2000 mL 圓底燒瓶中，并加入1000 mL 蒸餾水，進(jìn)行生姜精油的提取。保持微沸5 h 后停止加熱，冷卻，將提取的揮發(fā)油移至進(jìn)樣瓶中，避光冷藏備用。

1.3 揮發(fā)油化學(xué)成分GC/MS 分析

色譜條件:色譜柱:DB-5MS 彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序:起始溫度50 ℃，以4.00 ℃/min 的速率升溫到200 ℃，保持3.00 min;總分離時(shí)間為37.25 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣，載氣流量為1.0 mL/min(恒流)，進(jìn)樣量為:0.5 μL，分流比為:5∶1。

質(zhì)譜條件:標(biāo)準(zhǔn)電子轟擊(EI)離子源(70 eV)，離子源溫度:230 ℃;四級(jí)桿溫度:130 ℃，接口溫度:280 ℃;電子倍增器電壓:1.812 KV;掃描質(zhì)量范圍:30～450 amu，溶劑延遲3 min。

定性定量方法:采用質(zhì)譜庫檢索結(jié)合色譜保留指數(shù)進(jìn)行組分定性鑒定，以峰面積歸一法計(jì)算各組分的百分含量。

1.4 姜辣素的提取

對(duì)1～9 號(hào)生姜進(jìn)行以下處理:取2.0 g 已切成碎末的生姜于帶塞的圓底燒瓶中，精密稱定，再精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，待溶液冷卻后，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，定容于25 mL 的容量瓶中，并置于冰箱中冷藏備用。

1.5 姜辣素的HPLC 含量測(cè)定

1.5.1 色譜條件

島津公司LC-20AD 高效液相色譜儀，型號(hào)規(guī)格:LC-20AD。色譜柱:XB-C18(4.6×250 mm);流動(dòng)相:乙腈-0.01%磷酸(45/55);檢測(cè)波長:280 nm;流動(dòng)相流速:1.00 mL/min，進(jìn)樣量:20 μL。

1.5.2 6-姜酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以6-姜酚的含量表示姜辣素的含量。精密稱取6-姜酚對(duì)照品5.8 mg 定容于25 mL 的容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為232 μg/mL 的6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。用微量移液器精密移取已配制好的6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL 于進(jìn)樣瓶中，并標(biāo)號(hào)為1。將姜辣素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用甲醇稀釋2 倍、4 倍、8 倍、16 倍，得到質(zhì)量濃度為116、58.0、29.0、14.5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次標(biāo)號(hào)為2、3、4、5 號(hào)。分別取該系列對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，從而得到相應(yīng)的峰面積值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 精密度試驗(yàn)

日內(nèi)精密度:分別精取1.5.2 中的1、3、5 號(hào)對(duì)照品溶液10 μL，按照上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，分別記錄一系列峰面積，計(jì)算液相色譜儀的日內(nèi)精密度。

日間精密度:分別精取1.5.2 中的1、3、5 號(hào)對(duì)照品溶液10 μL，按照上述色譜條件，每隔24 h 進(jìn)樣一次，連續(xù)3 天，分別記錄一系列峰面積，計(jì)算液相色譜儀的日間精密度。

1.5.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別取2.0 g 已切成碎末的7 號(hào)郴州生姜4 份于帶塞的圓底燒瓶中，標(biāo)號(hào)為1、2、3、4，精密稱定，再精密加入甲醇25 mL，分別稱定重量。在2、3、4號(hào)中分別加入2 mL 濃度分別為14.5、58.0、232 μg/mL 對(duì)照品溶液，加熱回流1 h，待溶液冷卻后，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，定容于25 mL 的容量瓶中。分別取樣20 μL 注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.5.5 樣品的測(cè)定

將9 種已提取出姜辣素的樣品按1.5.1 的色譜條件進(jìn)行姜辣素含量的測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 生姜揮發(fā)油GC/MS 分離譜圖及其成分含量分析

按照1.2 所述方法提取1～9 號(hào)產(chǎn)地生姜中的揮發(fā)油，采用GC/MS 法按照1.3 中所述條件進(jìn)行分析，得到了揮發(fā)油總離子流圖，9 種不同產(chǎn)地的生姜揮發(fā)油總離子流圖形貌相似，但組分含量存在差異。通過檢索NIST 質(zhì)譜庫確定揮發(fā)油的成分，利用峰面積歸一法計(jì)算各組分含量，9 種生姜揮發(fā)油的定性定量結(jié)果按照出峰時(shí)間順序列于表1。從表1 可見，不同產(chǎn)地生姜揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量各有不同，其中能夠鑒定出的組分?jǐn)?shù)在24～28 種之間，占揮發(fā)油含量的85.31%～93.67%，主要為單萜和倍半萜化合物，且樣品中單萜類化合物含量占總組分的50% 以上。單萜化合物中主要有α-蒎烯(0.88%～4.1%)、莰烯(3.54%～14.53%)、冰片(0.34%～3.58%)、β-水芹烯(9.96%～20.15%)、檸檬醛(6.52%～12.49%)、β-檸檬醛(3.96%～7.44%)等，β-水芹烯含量最高。倍半萜類化合物中主要有姜黃烯(tr～5.52%)、姜烯(13.81%～19.74%)、β-紅沒藥烯(2.63%～3.34%)、β-倍半水芹烯(5.08%～6.22%)等，以姜烯含量為最高。生姜揮發(fā)油的主要化學(xué)成分與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致，但也存在一定的差異。文獻(xiàn)報(bào)道生姜揮發(fā)油中倍半萜化合物含量占50.66%，其中姜黃烯的含量為11.416%［15］。而本研究中倍半萜化合物含量僅占25%～36%，單萜化合物含量超過50%。姜黃烯的含量最多為5.52%，而姜烯含量高達(dá)13.81%～19.74%。這可能是因?yàn)椴煌漠a(chǎn)地，氣候等因素對(duì)生姜化學(xué)成分有一定的影響。

表1 不同產(chǎn)地生姜揮發(fā)油定性定量結(jié)果Table 1 Qualitative and quantitative results of ginger essential oils from different origins

注:“-”:未檢出;“tr”:少量。Note:“-”:not detected;“tr”:trace amount.

2.2 生姜姜辣素HPLC 分析鑒定結(jié)果

2.2.1 HPLC 分離效果

根據(jù)1.5.1 所述的色譜條件，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品與樣品的姜辣素的測(cè)定，得到的色譜分離情況如圖1所示。由圖可知，分離效果好，6-姜酚色譜峰保留時(shí)間約為13.6 min。

圖1 6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品(B)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 6-gingerol standard(A)and tested sample(B)

2.2.2 線性關(guān)系的考察

依據(jù)1.5.2 的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定6-姜酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。以6-姜酚的含量(μg/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計(jì)算。結(jié)果表明6-姜酚在14.5～232 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程為:Y=14000X+49637，R2=0.9998。

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

依據(jù)1.5.3 的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行精密度試驗(yàn)，計(jì)算得儀器日內(nèi)精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 及日間精密度RSD。梔子苷濃度為14.5 μg/mL 時(shí)，日內(nèi)精密度RSD 1.7%，日間精密度RSD 2.9%;梔子苷濃度為58.0 μg/mL 時(shí)，日內(nèi)與日間精密度RSD 分別為0.8%和1.2%;梔子苷濃度為232 μg/mL 時(shí)，日內(nèi)與日間精密度RSD 分別為0.42%和0.6%。由此得知，該儀器精密度良好。

2.2.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

由1.5.4 中所述方法測(cè)定對(duì)7 號(hào)生姜進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量5 次，結(jié)果如表2 所示。數(shù)據(jù)表明加樣平均回收率為96.16%±2.49%。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=5，x±S)Table 2 Recovery experiment results(n=5，x±S)

2.2.5 樣品的測(cè)定

按照1.4 中方法提取1～9 號(hào)生姜樣品中的姜辣素，并在1.5.1 的色譜條件下，進(jìn)樣量為10 μL，進(jìn)行HPLC 分析，平行測(cè)定測(cè)3 次，得到的相應(yīng)峰面積，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出6-姜酚的含量，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析得到的結(jié)果如表3 所示。由表3可知，9 種生姜樣品中6-姜酚含量各有不同，在0.067%～0.391%之間，其中4 號(hào)生姜中6-姜酚的含量最高達(dá)到0.391%，是3 號(hào)生姜中6-姜酚含量的5.8 倍，但所有樣品中6-姜酚的含量均不低于0.050%，符合2010 版中國藥典的要求。

表3 不同產(chǎn)地生姜中6-姜酚的含量(n=3，x±S)Table 3 The contents of gingerols in ginger samples from different origins(n=3，x±S)

2.3 生姜主要活性成分的比較分析

生姜醇提取物中6-姜酚的含量和生物活性最高，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、保肝、抑制細(xì)胞衰老等多種藥用價(jià)值［5］。本研究中9 種生姜樣品中6-姜酚的含量均符合2010 版中國藥典的要求。然而生姜揮發(fā)油中多種成分也具有重要作用，如β-水芹烯具有祛痰、殺蟲等重要的生理活性［16］，檸檬醛、β-檸檬醛可用作制造柑橘香味食品香料，冰片具有發(fā)汗、興奮、鎮(zhèn)痙、驅(qū)蟲等作用［17］，α-蒎烯對(duì)白色念珠菌的生物合成有顯著的抑制作用［18］，莰烯、冰片、檸檬醛、β-檸檬醛都有殺菌等作用［19］;倍半萜類化合物姜烯可作止痛劑［17］，姜黃烯有一定的抑癌活性［20］，姜烯和姜黃烯同時(shí)具有抗病毒、抗生育、抗?jié)儯?5］等多種活性，β-紅沒藥烯也具有一定的抗生育活性［21］。因此，僅以6-姜酚的含量評(píng)價(jià)生姜質(zhì)量顯然有些片面。本文對(duì)生姜揮發(fā)油的定性定量分析結(jié)果顯示，姜烯、姜黃烯為生姜揮發(fā)油中具有重要生理活性的主要特征性成分。鑒于此，我們提出將姜烯、姜黃烯與6-姜酚共同作為生姜的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3 結(jié)論

通過對(duì)9 種不同產(chǎn)地的生姜主要活性成分的比較分析，得到如下結(jié)論:(1)從9 種不同產(chǎn)地的生姜揮發(fā)油中鑒定出24～28 種化學(xué)成分，含量在85.31%～93.67%之間，主要為單萜和倍半萜類化合物，其中β-水芹烯和姜烯含量最高;(2)9 種生姜樣品中姜辣素含量各有不同，在0.067%～0.391%之間，均符合現(xiàn)行中國藥典規(guī)定的不低于0.050%的規(guī)定;(3)主要活性成分姜烯(13.81%～19.74%)和姜黃烯(tr～5.52%)含量高，且為姜的特征成分，因此提出以姜烯、姜黃烯和6-姜酚共同作為生姜的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

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