類芽孢桿菌BD3526 抑菌活性物質(zhì)的初步分離及性質(zhì)測定

劉玉娟，韓 瑨，吳 江，劉振民，郭本恒，吳正鈞*

1乳業(yè)生物技術國家重點實驗室 光明乳業(yè)股份有限公司，上海 200436;2 上海海洋大學食品學院，上海 201306

類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)細菌是廣泛存在于自然界，好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子的桿狀細菌，其生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢種群之一。類芽孢桿菌原屬于芽孢桿菌屬，1994 年Ash 等［1］基于分子生物學的研究結果，將其從芽孢桿菌屬中獨立出來，成立類芽孢桿菌屬。類芽孢桿菌屬的菌株在生長過程中，能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，有利于其在環(huán)境中存活、定殖與繁殖，在產(chǎn)品開發(fā)中因較非芽孢桿菌屬細菌有效活菌數(shù)量高、性能穩(wěn)定等優(yōu)勢而備受矚目，是芽孢桿菌中比較具有應用潛力的菌種之一［2］。其中某些菌株也是重要的植物生防細菌和植物根際促生菌，并且在農(nóng)業(yè)領域已得到廣泛的應用［3］。

類芽孢桿菌中的某些菌株，在代謝過程中可產(chǎn)生如多糖、酶、拮抗蛋白、抗生素、植物激素、絮凝劑等多種生物活性物質(zhì)［4］，這些活性物質(zhì)在環(huán)境治理、植物病害防治以及畜牧業(yè)方面具有誘人的應用前景。在其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)中，最主要的是多粘菌素(polymyxin)，它是由多種氨基酸和脂肪酸組成的堿性脂肽類抗生素，有A、B、C、D、E 五中類型，分子量都在1200 Da 左右，對G-菌有明顯抑制作用［5］。目前研究較多的是多粘菌素B，它除了對G-菌有明顯殺菌作用外，還能對其產(chǎn)生的內(nèi)毒素有一定的抑制作用，但由于其本身的腎毒性和神經(jīng)毒性，一度限制了它在臨床上的應用［6］。還有一類尚未統(tǒng)一命名，它們都含有一個稀有脂肪酸側(cè)鏈，即15-胍基-3-羥基十五烷酸(GHPD)，這類物質(zhì)主要包括gatavalin，fusaricidins A、B、C、D 或LI-F 系列抗生素［7］，分子量大都是900 Da 左右，對白色念珠菌、釀酒酵母菌、黑曲霉、米曲霉、尖孢鐮刀菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等具有很好的拮抗作用。

本文對Paenibacillus sp.BD3526 產(chǎn)生的類細菌素抗菌物質(zhì)進行了研究，為今后該菌在醫(yī)藥、食品和飼料加工等領域的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

本實驗所用拮抗菌為Paenibacillus sp.BD3526(CGMCC 8333=DSM 28815)，是從西藏地區(qū)耗牛奶中分離得到。指示菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CGMCC1.879，藤黃微球菌(Micrococcus luteus)CGMCC1.1848，單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)CGMCC1.9136，均由乳業(yè)生物技術國家重點實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

TYC 培養(yǎng)基(g/L;酪朊水解物15 g，酵母抽提物5 g，蔗糖50 g，無水乙酸鈉20 g，NaCl 1 g，NaHCO32 g，無水Na2SO40.1 g，L-胱 氨 酸0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2 g);營養(yǎng)肉湯(g/L;蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g)，固體培養(yǎng)基加入1.2%的瓊脂，培養(yǎng)基121 ℃高壓滅菌15 min 后備用。

1.1.3 酶的品種及編號

胰蛋白酶(1800 U/mg，Sigma，CAS:9002-07-7)，胃蛋白酶(427 U/mg，Sigma，CAS:9001-75-6)，脂肪酶(400 U/mg，Sigma，CAS:9001-62-1)，蛋白酶K(30 U/mg，Sigma，CAS:39450-01-6)，鏈霉蛋白酶(3.5 U/mg，Sigma，CAS:9036-06-0)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng)

拮抗菌株的培養(yǎng):將預先保藏的菌種BD3526接種至TYC 固體平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，菌種活化兩代備用。指示菌的培養(yǎng):指示菌接種于LB 固體平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于15 mL 營養(yǎng)肉湯中，37 ℃，180 rpm，培養(yǎng)20 h，菌液稀釋備用。

1.2.2 抑菌活性的測定

采用點種法［8］。培養(yǎng)好的指示菌菌液，與營養(yǎng)瓊脂混合均勻，使最終指示菌濃度為105cfu/mL，將培養(yǎng)基倒入平板中，待其表面水分蒸發(fā)完全后，吸取10 μL 待測樣品滴加在指示菌平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結果。根據(jù)抑菌圈的大小判斷樣品活性強弱。

1.2.3 MIC 的測定

最低抑菌濃度是衡量抑菌物質(zhì)性能的一個關鍵指標。本實驗采用倍半稀釋法對待測樣品進行稀釋，將樣品稀釋到原溶液濃度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32，分別滴加到指示菌平板上，觀察抑菌圈的出現(xiàn)情況，能抑制培養(yǎng)基內(nèi)指示菌生長的最低濃度則為該樣品的MIC 值［9］。

1.2.4 抑菌率的測定

無菌96 孔板中依次加入50 μL 初步純化樣品、180 μL LB 培養(yǎng)基、20 μL 指示菌菌液，使最終樣品孔中菌濃為105cfu/mL，以無菌水代替樣品作為對照?；靹蚝笾糜?7 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 h用酶標儀(Spectra M5，Molecular Devices)測定OD600值［10］，共測量18 h。抑菌率按下式計算:

式中，A 為對照組OD600值，A1 為樣品組OD600值。

1.2.5 樣品的純化

將平板上菌體刮下，加入丙酮浸提1 h，連續(xù)浸提3 次，將3 次浸提液合并，9000 rpm，10 min，4 ℃離心取上清，去除有機溶劑，真空凍干，得到含有抑菌活性物的粗品。凍干后的粗品用甲醇復溶配成濃度為100 mg/mL 的溶液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后，通過Sephadex LH-20 分離，甲醇洗脫，流速為0.6 mL/min，每150 s 收集一管，共收集2 個柱體積。分別檢測各管抑菌活性，收集活性組分。

1.2.6 熱穩(wěn)定性測定

將初步純化的樣品用純水配成2 mg/mL 溶液，分別吸取0.5 mL 樣品，置于50、60、70、80、90 ℃水浴中保溫2 h，沸水浴15 min，121 ℃條件下處理5 min，以未經(jīng)熱處理的樣品作對照，檢測抑菌活性。實驗設三個平行，并比較組間差異性大小。

1.2.7 pH 適用范圍的測定

稱取初步純化樣品0.5 mg，分別溶解在pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10 的磷酸鹽緩沖溶液中，配成濃度為2 mg/mL 的溶液，檢測抑菌活性，以pH 7 樣品作對照，比較不同pH 條件下抑菌圈大小。實驗設三個平行，取平均值比較差異性大小。

1.2.8 蛋白酶敏感性測定

4 mg/mL 樣品溶液分別調(diào)節(jié)至各酶的最適pH，以1∶3 的比例將酶與樣品溶液混合，使酶最終濃度為1 mg/mL，將混合液在37 ℃水浴中保溫2 h，調(diào)節(jié)pH 至中性，以加入同等體積的磷酸鹽緩沖溶液樣品作為對照，檢測抑菌活性［11］。

1.2.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù)，單因素方差分析進行顯著性實驗，并用LSD-t 進行組間差異性比較，P＜0.05 表示差異顯著具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 樣品的純化

微生物代謝產(chǎn)物大部分是分泌到周圍環(huán)境中，但也有少數(shù)物質(zhì)是粘附在菌體表面［12］。Paenibacillus sp.BD3526 在發(fā)酵過程中，已經(jīng)證實其產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)，既粘附在菌體表面，也分泌到周圍環(huán)境中。實驗初期階段，以菌體發(fā)酵液為研究對象，對抑菌物質(zhì)進行分離純化，由于在發(fā)酵過程中，受溫度、時間、通氧量等影響，檢測到抑菌活性不穩(wěn)定。所以粗提物的制備直接選用菌體，經(jīng)有機溶劑浸提，再減壓去除溶劑后，冷凍干燥，得到抑菌活性物質(zhì)粗品C。

粗品C 甲醇復溶通過Sephadex LH-20 分離，洗脫曲線見圖1，其中第72 管至78 管，即洗脫體積為柱體積的3/5～4/5 時，活性組分流出。為了盡量減少雜質(zhì)的帶入，獲得較高純度的目的物質(zhì)，選擇73、74、75、76、77 五管合并，作為初步純化后活性組分P。

圖1 Sephadex LH-20 洗脫曲線Fig.1 Elution chromatogram of the antimicrobial components of BD3526 on Sephadex LH20

2.2 MIC 的測定

抑菌物質(zhì)粗品C 純水復溶，倍半稀釋法配成以下濃度:200、100、50、25、12.5、6.25 mg/mL;Sephadex LH-20 初步純化后的抑菌物質(zhì)活性組分P 純水復溶，倍半稀釋法配成以下濃度:8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL，以金黃色葡萄球菌CGMCC1.879，藤黃微球菌CGMCC1.1848，單增李斯特菌CGMCC1.9136 為指示菌檢測抑菌活性，結果見表1 和表2。由表1和表2 可知，粗品濃度為12.5 mg/mL，Sephadex LH-20 純化樣品濃度為1 mg/mL 時，藤黃微球菌CGMCC1.1848 未有長出;粗品濃度為25 mg/mL，SephadexLH-20 純化樣品濃度為2 mg/mL 時，金黃色葡萄球菌CGMCC1.879 和單增李斯特菌CGMCC1.9136未有長出，由此得出，粗品對藤黃微球菌CGMCC1.1848 的MIC 是12.5 mg/mL，對金黃色葡萄球菌CGMCC1.879 和單增李斯特菌CGMCC1.9136 的MIC 值為25 mg/mL;Sephadex LH-20 純化樣品對藤黃微球菌CGMCC1.1848 的MIC 是1 mg/mL，對金黃色葡萄球菌CGMCC1.879 和單增李斯特菌CGMCC1.9136 的MIC 值為2 mg/mL。經(jīng)過SephadexLH-20 分離，樣品的MIC 值縮小了12.5 倍，表明樣品得到了有效的純化。

表1 粗品各濃度抑菌活性Table 1 Antimicrobial activity of crude extracts with different concentrations

表2 Sephadex LH-20 純化樣品各濃度抑菌活性Table 2 Antimicrobial activity of purified fraction in different concentrations

同時，由以上數(shù)據(jù)可知，藤黃微球菌CGMCC1.1848 的MIC 值明顯低于金黃色葡萄球菌CGMCC1.879 和單增李斯特菌CGMCC1.9136 的MIC 值，故在測定抑菌物質(zhì)的性質(zhì)時，選擇敏感性較高的藤黃微球菌CGMCC1.1848 作為指示菌。

2.3 熱穩(wěn)定性測定

初步純化樣品P 經(jīng)不同溫度處理后，樣品抑菌圈直徑平均值見圖2。經(jīng)SPSS 21.0 分析，組間比較，與未經(jīng)熱處理的樣品相比，50、60、70、80、90、100、121 ℃處理后樣品活性均沒有顯著性差異(P ＞0.05)，結果表明該樣品有良好的熱穩(wěn)定性。

2.4 pH 適用范圍的測定

圖2 不同溫度處理后樣品抑菌圈直徑Fig.2 Diameter of inhibition zone with different heat treatments

不同pH 值條件下，樣品抑菌圈直徑平均值見表3。選擇pH7 條件下抑菌圈直徑做對照，以其他pH 值條件下抑菌圈直徑和其差值為縱坐標作圖，結果見圖3，由圖可知，在pH 小于7 的情況下，抑菌圈的直徑隨著酸性的增強而減小，表明在酸性條件下，抑菌活性會受到一定抑制，pH 在7～9 范圍內(nèi)，抑菌圈直徑增大，說明抑菌物質(zhì)活性增強，pH 大于9 時，與對照組相比，抑菌圈直徑減小，活性有所減弱。由此可見，該抑菌活性物質(zhì)在偏堿性條件下，抑菌作用最強。

表3 不同pH 條件下樣品抑菌圈直徑Table 3 Inhibition diameter with different pH values

圖3 不同pH 條件下抑菌圈直徑的比較Fig.3 Comparison of inhibition diameter with different pH values

2.5 蛋白酶敏感性測定

初步純化樣品P，經(jīng)不同酶處理后各樣品活性見下圖，由圖4 可知，樣品經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶K 處理后，活性沒有明顯變化，而經(jīng)鏈霉蛋白酶處理后，活性基本消失。依據(jù)上述結果，進一步分析初步純化樣品P 在液體培養(yǎng)狀態(tài)下，對藤黃微球菌CGMCC1.1848 的抑菌作用，結果見圖5。在1 mg/mL 濃度下，初步純化樣品P 經(jīng)鏈霉蛋白酶處理后，抑菌活性明顯下降，在0～18 h 內(nèi)，未經(jīng)酶處理的初步純化樣品P 對藤黃微球菌CGMCC1.1848 的最高抑菌率為90.43%，而經(jīng)鏈霉蛋白酶處理后樣品最高抑菌率為17.45%。與鏈霉蛋白酶相比，其它酶類作用專一性強，有特異性水解位點，而鏈霉蛋白酶是一種肽酶，對作用位點肽鍵的氨基酸組成沒有特定的選擇性，結果表明活性組分可能是肽類物質(zhì)。

圖4 胰蛋白酶(A)、胃蛋白酶(B)、脂肪酶(C)、蛋白酶K(D)、鏈霉蛋白酶(E)處理后樣品及對照組(F)的抑菌活性Fig.4 Antimicrobial activities of control (F)and samples digested by trypsin (A)，pepsin (B)，lipase (C)，protease K (D)，pronase (E)

圖5 鏈霉蛋白酶處理前后樣品抑菌率Fig.5 Inhibition rate of samples before and after digestion by pronase

3 結論

本實驗以一株類芽孢桿菌BD3526 為研究對象，采用有機溶劑浸提菌體的方法，分離得到對G+菌有明顯抑制作用的活性組分，并對其進行了初步的性質(zhì)測定。經(jīng)不同溫度處理后，樣品活性基本保持不變。酸堿適用范圍實驗表明，樣品在酸性條件下，活性會受到些許抑制，在中性偏堿條件下，樣品活性最高。樣品經(jīng)鏈霉蛋白酶處理后活性基本消失，表明該活性物質(zhì)可能是肽類物質(zhì)，這與文獻報道基本一致［13，14］。

鑒于微生物在發(fā)酵過程中，受到影響因素較多，活性不穩(wěn)定等問題，抑菌物質(zhì)的提取可以以菌體作為介質(zhì)，直接破碎細胞得到。經(jīng)過實驗驗證，以菌體為介質(zhì)，重現(xiàn)性較好，但樣品組分較為復雜，為分離純化增加了困難。本實驗主要采用了凝膠層析獲得了初步純化的樣品，但若想得到純度較高的樣品，作進一步的結構分析，則還需對樣品進行純化。

目前，乳酸鏈球菌素(Nisin)是唯一被批準應用在食品中的細菌素［15］，但其抑菌譜較窄，只對G+菌和部分芽孢菌有抑制作用，對G-菌沒有作用，而且Nisin 只有在低酸條件下，才能發(fā)揮作用，在中性及偏堿性條件下，幾乎全部失活［16］。本實驗所用供試菌株BD3526，是從西藏耗牛奶中分離得到，該菌在血平板上未見溶血(數(shù)據(jù)未公開)，同時，目前已有多種(株)類芽孢作為益生菌在醫(yī)藥和畜牧養(yǎng)殖上應用，保證了菌種的安全性。因此，在食品、醫(yī)藥、環(huán)境工程等方面具有很高的應用潛力。

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