銀杏葉聚戊烯醇急性和遺傳性毒理學(xué)研究

王成章，葉建中，原姣姣，李文君，張紅玉

1 中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室;國家林業(yè)局 林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，南京 210042;2 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091

銀杏(Ginkgo biloaba L.，G.biloaba L.)，又名白果，俗稱公孫樹，是世界上最古老的孑遺植物之一，原產(chǎn)于中國，于1710 年左右引入歐洲，素有“活化石”、“植物界的熊貓”之稱。銀杏葉是銀杏重要的藥用部位，含有黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、聚戊烯醇、揮發(fā)油及甾醇等生物活性成分，是傳統(tǒng)的中藥材［1］。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，銀杏葉具有益心斂肺、化濕止瀉等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明銀杏黃酮對于冠狀血管具有擴張作用，能促進血管收縮，降低血清膽固醇，升高血清磷脂，改善磷脂與血清膽固醇比例［2］。銀杏內(nèi)酯具有明顯的腦保護作用，有效改善腦組織神經(jīng)細(xì)胞缺血。目前國際市場上開發(fā)的銀杏葉提取物及制劑在臨床上廣泛用于心腦血管疾病的預(yù)防與防治［3］。銀杏葉多糖與某些常用化療藥物具有明顯協(xié)同抗癌效應(yīng)，對于抑制腫瘤細(xì)胞生長效果明顯。銀杏葉聚戊烯醇(polyprenols，GBP)是繼銀杏黃酮和內(nèi)酯后發(fā)現(xiàn)的一類重要天然活性成分，它是由14～24 個異戊烯基單元組成的長鏈狀類脂同系物，與哺乳動物和人體中S-多萜醇(Dolichols，DH)結(jié)構(gòu)十分相似，即ω-(trans)2-(cis)n-cis(α)結(jié)構(gòu)(見圖1)［4］。多萜醇中cis(α)異戊醇有一個手性碳原子，是S 構(gòu)型天然類脂化合物，具有光學(xué)活性，而銀杏葉聚戊烯醇中cis(α)為不飽和異戊醇［5，6］。

圖1 多萜醇與銀杏葉聚戊醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)(n=12～18)Fig.1 Chemical structures of dolichols and polyprenols of G.biloba(n=12-18)

多萜醇含有不飽合雙鍵，具有抗氧化、清除脂質(zhì)自由基作用，在人體內(nèi)的生理作用非常廣泛。多萜醇及其磷酸鹽具有促進人體造血功能的作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜穩(wěn)定性和通透性。多萜醇磷酸鹽作為糖基關(guān)鍵載體在糖蛋白的生物合成過程中起著非常重要的作用，體內(nèi)多萜醇及其磷酸鹽不足將引起脂質(zhì)代謝、糖類代謝和蛋白質(zhì)代謝的紊亂，對細(xì)胞免疫功能及細(xì)胞分裂和再生產(chǎn)生影響，并導(dǎo)致細(xì)胞病變［7-9］。多萜醇能治療再生障礙性貧血、糖尿病、高尿酸、痛風(fēng)、紅斑狼瘡等免疫性低下引起的疾病，尤其能抑制B16-F10 黑色素腫瘤轉(zhuǎn)移和輔助化療P388 白血病腫瘤［10，11］。研究表明，外源性植物聚戊烯醇(plant polyprenols)攝入體內(nèi)可通過α-異戊二烯還原酶(α-isoprene reductase)的作用代謝成聚戊烯醇磷酸鹽(polyprenyl phosphate，Poly-PP)和多萜醇焦磷酸(Dol-PP)，再通過多萜醇焦磷酸磷酸酯酶(Dol-PP phosphatase)代謝成多萜醇磷酸鹽(Dol-P)，最后經(jīng)多萜醇磷酸酯酶(Dol-P phosphatase)轉(zhuǎn)化為多萜醇，形成多萜醇磷酸酯的生物循環(huán)，進行生物的新陳代謝［9］。王成章研究了銀杏葉聚戊烯醇化學(xué)結(jié)構(gòu)和含量變化規(guī)律［4，12］、抗腫瘤、促進腫瘤細(xì)胞凋亡、輔助化放療、保護肝損傷、抗病毒，免疫調(diào)節(jié)以及抑菌等生物活性［13-19］，但尚未見銀杏葉聚戊烯醇毒理學(xué)評價的相關(guān)報道，因而限制了銀杏葉聚戊烯醇的功能食品和藥品的開發(fā)。本研究以銀杏葉聚戊烯醇為原料，根據(jù)新藥非臨床安全性評價原則，采用急性口服灌胃試驗、Ames 試驗、骨髓細(xì)胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗，對銀杏葉聚戊烯醇急性和遺傳性毒理進行評價，為銀杏葉聚戊烯醇的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試樣品和化學(xué)試劑

銀杏葉聚戊烯醇(GBP)，聚戊烯醇≥75%，橙黃色透明油狀物，實驗室自制。二甲基亞砜(DMSO)和雙蒸水均為分析試劑，陽性對照物敵克松(Dexon)、2-氨基芴(2-AF)、1，8-二羥基蒽醌、環(huán)磷酰胺和絲裂霉素C(MMC)購于SIGMA 公司。生化試劑盒由中生北控生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物和菌株

健康ICR 小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，二級，合格證號:SCXK(滬)2003-0003 號。實驗動物環(huán)境設(shè)施合格證號:SCXK(滬)2002-0004 號。滅菌鼠飼料和無菌水自由食用。菌株TA97、TA98、TA100 和TA102經(jīng)鑒定基因型符合要求，各菌株過夜培養(yǎng)液細(xì)菌濃度均在109個/mL 或以上。

細(xì)胞及培養(yǎng)條件CHL 細(xì)胞，由江蘇省疾病控制中心遺傳毒理室提供。完全培養(yǎng)液為含10%小牛血清的DMEM，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。

1.2.2 急性毒性試驗

銀杏葉聚戊烯醇(GBP)設(shè)計5 個劑量組5 g/kg b·wt.、7.5 g/kg b·wt.、10 g/kg b·wt.、15 g/kg b·wt.、和21.5 g/kg b·wt.，分別稱取GBP 樣品加色拉油至20 mL 配制成受試物。每組小鼠10 只，雌雄各半。GBP 給藥小鼠禁食過夜后分2 次灌胃給予，中間間隔4 h，每次灌胃容量均為20 mL/kg b·wt.，末次灌胃后4 h 給食，自由攝食。空白對照組雌雄各半，給予等體積生理鹽水。給藥后正常飼養(yǎng)，連續(xù)觀察記錄14 d 內(nèi)小鼠體重、進食、活動、精神等反應(yīng)情況。選擇GBP 最大給藥量的雌雄組，14 d 后測定小鼠血液指標(biāo)，剖解觀察主要臟器(心、肝、脾、腎)的變化。取心、肝、脾、腎，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重，計算各臟器指數(shù)(各臟器重量與體重之比)。

1.2.3 Ames 試驗［19］

S9 混合液中S9 濃度為10%，其中S9 是由Aroclor1254 誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿。按照試驗要求［20］，對試驗擬用的鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株進行了組氨酸需求試驗、結(jié)晶紫敏感試驗、抗氨芐青霉素試驗、抗四環(huán)素試驗、紫外線敏感試驗和自發(fā)回變試驗［21］，結(jié)果顯示:各菌株的特性正常，自發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)，菌株基因型均符合試驗要求。

稱取GBP 樣品500 mg，用二甲基亞砜(DMSO)定容至10 mL，37 ℃提取過夜，離心取上清液，并以此連續(xù)用DMSO 作5 倍稀釋，共設(shè)GBP5 個劑量組(8，40，200，1000，5000 μg/皿)、2 個溶劑對照組(0.1 mL/皿DMSO 和0.1 mL/皿雙蒸水)。另設(shè)3 個陽性對照組，陽性對照物敵克松(Dexon，50 μg/皿)、2-氨基芴(2-AF，10 μg/皿)和1，8-二羥基蒽醌(50 μg/皿)分別用雙蒸水和DMSO 溶解。采用平板摻入法，共測試兩次，每次每個劑量設(shè)平行樣3 個。

1.2.4 微核試驗

分別稱取GBP 2.5、5、10 g 樣品加色拉油到20 mL 配制成受試物，陽性對照取環(huán)磷酰胺40 mg 加生理鹽水到20 mL 使成為2 mg/mL 的溶液。小鼠按體重隨機分入2.5、5、10 g/kg b·wt 各3 個劑量組、1 個溶劑對照組(色拉油)和1 個陽性對照組(環(huán)磷酰胺20 mL/kg)，每組10 只，雌雄各半。各組均用30 h 兩次灌胃法，每次灌胃容量均為20 mL/kg，第2次灌胃后6 h 殺鼠，取股骨骨髓懸于牛血清中直接涂片、固定、染色，鏡檢嗜多染紅細(xì)胞1000 個/鼠，計數(shù)具有微核的細(xì)胞，觀察嗜多染紅細(xì)胞和正染紅細(xì)胞比率(PCE/NCE)。

1.2.5 畸形試驗

分別稱取GBP 2.5、5、10 g 樣品加色拉油到20 mL 配制成受試物，陽性對照取絲裂霉素C(MMC)2 mg/支加生理鹽水10 mL 使成為0.2 mg/mL 的溶液。小鼠按體重隨機分入3 個樣品劑量組，1 個溶劑對照組(色拉油)和1 個陽性對照，每組5 只雄性小鼠。樣品各劑量組和溶劑對照組動物連續(xù)灌胃5天，每次灌胃容量均為20 mL/kg，每天一次。陽性對照物絲裂霉素C(MMC)以10 mL/kg 的量一次腹腔注射。各組動物均于處死前6 h 腹腔注射秋水仙素4 mg/kg，實驗第12 d 殺鼠取睪丸，拉開精曲細(xì)管，低滲，固定，軟化，制片，染色，鏡檢。

1.2.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計處理計量資料，多組問比較采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)和兩兩比較采用Dunnett 法和LSD 法;計數(shù)資料采用卡方檢驗，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GBP 對小鼠急性經(jīng)口毒性影響

銀杏葉聚戊烯醇(GBP)設(shè)計劑量5 g/kg b·wt、7.5 g/kg b·wt、10 g/kg b·wt、15 g/kg b·wt 和21.5 g/kg b·wt，聚戊烯醇溶液用20 mL 色拉油制備。當(dāng)用量在10 g/kg 以上時，使用未稀釋的聚戊烯醇。按照最大給藥體積對小鼠灌胃兩次后，喂養(yǎng)14 d 未發(fā)現(xiàn)動物行為和外表的明顯變化，未見死亡。用量達21.5 g/kg 時，動物在灌胃1～2 h 內(nèi)少動，并在24 h 內(nèi)胃腸道暫時紊亂。因此用灌胃法不能測定其半數(shù)到死量，因為其數(shù)量將大于小鼠的最大容許灌胃量，再增加灌胃量將導(dǎo)致小鼠胃腸系統(tǒng)的損傷，小鼠最大給藥量21.5 g/kg。GBP 試驗組與空白對照組小鼠體重均呈增長趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)(表1)。一般體征觀察2 次給藥后，除給藥當(dāng)天小鼠少動且進食、飲水稍有減少外，在14 d 的觀察期內(nèi)試驗組小鼠活動正常、反應(yīng)靈敏、進食飲水、尿便等均正常，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，與空白對照組無明顯差異。根據(jù)小鼠急性經(jīng)口毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，GBP 屬無毒級。

表1 銀杏葉聚戊烯醇(GBP)對小鼠體重和急性毒性的影響(±s，n=5)Table 1 Effect of GBP on body weight and acute toxicity of mouse(±s，n=5)

表1 銀杏葉聚戊烯醇(GBP)對小鼠體重和急性毒性的影響(±s，n=5)Table 1 Effect of GBP on body weight and acute toxicity of mouse(±s，n=5)

選擇GBP 最大給藥量雌雄組，14 d 后剖檢心、肝、脾、腎重要臟器，GBP 給藥組與空白對照組小鼠各臟器均未見腫大、出血、壞死等異常變化。臟器系數(shù)結(jié)果表明，GBP 給藥雌雄組心體比、肝體比、脾體比、腎體比與空白對照組無顯著性差異(P＞0.05)(表2);從血液指標(biāo)分析表3 可看出，GBP 試驗雌雄組組血液紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(HGB)、堿性磷酸酶(ALT)、天門冬氨酸氨基移換酶(AST)與對照組無顯著性差異(P＞0.05)，均在正常范圍內(nèi)，表明GBP 在最大給藥量(21.5 g/kg)不影響小鼠的生化指標(biāo)和臟器系數(shù)，因此，GBP 未見毒性。

表2 GBP 給藥對小鼠的臟器系數(shù)的影響/%(±s，n=5)Table 2 Effect of GBP on organ/body weight ratio of mouse/%(±s，n=5)

表2 GBP 給藥對小鼠的臟器系數(shù)的影響/%(±s，n=5)Table 2 Effect of GBP on organ/body weight ratio of mouse/%(±s，n=5)

表3 GPB 給藥對小鼠血液生理生化指標(biāo)的影響(±s，n=5)Table 3 Effect of GBP on blood physiological and biochemical indexes of mouse(±s，n=5)

表3 GPB 給藥對小鼠血液生理生化指標(biāo)的影響(±s，n=5)Table 3 Effect of GBP on blood physiological and biochemical indexes of mouse(±s，n=5)

2.2 Ames 試驗結(jié)果

計算同一菌株同一劑量組的3 個平行培養(yǎng)皿上的平均菌落數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，兩次試驗結(jié)果統(tǒng)計如表4。陽性對照組各菌株回變菌落平均數(shù)均超過其相應(yīng)陰性對照組回變菌落平均數(shù)的2 倍以上，證實鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株對受試物的檢測有效。隨著GBP 受試物劑量的增加，突變菌落數(shù)變化很少，GBP 各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過陰性對照(自發(fā)回變)菌落數(shù)的2 倍，且無劑量反應(yīng)關(guān)系，說明在加與不加S9 的條件下，TA97、TA98、TA100、TA102 的自發(fā)回變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)，GBP 受試物對標(biāo)準(zhǔn)測試菌TA97、TA98、TA100 和TA102 均未檢出明顯的誘變活性。

表4 GBP 的Ames 試驗S9 菌株的回變結(jié)果(±s，n=3)Table 4 Effect of GBP on S9 bacterial strain in the Ames test(±s，n=3)

表4 GBP 的Ames 試驗S9 菌株的回變結(jié)果(±s，n=3)Table 4 Effect of GBP on S9 bacterial strain in the Ames test(±s，n=3)

2.3 微核試驗結(jié)果

環(huán)磷酰胺陽性對照組的微核率與溶劑對照組相比，有極顯著差異(P＜0.01)，證明試驗系統(tǒng)可靠。GBP 各劑量組小鼠微核率與陽性對照組有極顯著性差異(P＜0.01)，GBP 各劑量組間無顯著性差異(P＞0.05)。GBP 各給藥劑量組嗜多染紅細(xì)胞/正染紅細(xì)胞的比值與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，并且PCE/NCE 比率均大于0.1，表明GBP 微核試驗結(jié)果呈陰性，對骨髓紅細(xì)胞系統(tǒng)的增殖無明顯受抑，對嗜多染紅細(xì)胞微核的觀察無明顯影響，如表5。

表5 GBP 對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗結(jié)果(±s，n=5)Table 5 Effect of GPB on bone marrow polychromatie erythrocyte micronucleus of mouse(±s，n=5)

表5 GBP 對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗結(jié)果(±s，n=5)Table 5 Effect of GPB on bone marrow polychromatie erythrocyte micronucleus of mouse(±s，n=5)

注:與溶劑對照值相比，＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，＊＊P＜0.01.

2.4 染色體畸變試驗結(jié)果

染色體畸變試驗結(jié)果表明:溶劑對照組染色體畸變率為0，MMC 陽性對照中直接誘變劑絲裂霉素組細(xì)胞染色體畸變率增高8.4%，陽性對照值與溶劑對照值之間有極顯著差異(P＜0.01)，表明本試驗系統(tǒng)可靠。GBP 劑量組隨給藥量增加，各劑量組間小鼠具染色體畸變的初級精母細(xì)胞率與溶劑對照值之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，也無劑量反應(yīng)關(guān)系，如表6。因此，在GBP 受試劑量下，未檢出GBP 對雄性小鼠睪丸初級精母細(xì)胞染色體的誘變活性。

表6 GBP 對小鼠睪丸初級精母細(xì)胞染色體畸變試驗結(jié)果(±s，n=5)Table 6 Effect of GBP on primary spermatocyte chromosome aberration of mouse(±s，n=5)

表6 GBP 對小鼠睪丸初級精母細(xì)胞染色體畸變試驗結(jié)果(±s，n=5)Table 6 Effect of GBP on primary spermatocyte chromosome aberration of mouse(±s，n=5)

注:a:斷片、易位、微小體等;與溶劑對照值相比，＊＊P＜0.01。Note:a:Fragment，translocation，microbody;Compare with control，＊＊P＜0.01.

3 討論

國際上對于針葉聚戊烯醇生物活性和安全性研究已有大量報道。俄羅斯和拉脫維亞按照前蘇聯(lián)衛(wèi)生部藥物委員會“新藥用物質(zhì)臨床前毒理試驗要求”對針葉聚戊烯醇進行毒理安全評價，實驗結(jié)果表明，聚戊烯醇對人體安全無毒，無致突變、致畸及致癌作用，已批準(zhǔn)針葉聚戊烯醇作為食品和化妝品原料已使用20 年。俄羅斯利用針葉聚戊烯醇開發(fā)了“ROPREN”制劑，在免疫功能、護肝、多發(fā)性硬化癥、抗肝炎病毒和艾滋病毒以及輔助化療白血病等方面具有明顯的藥效;并開發(fā)噴霧劑用于預(yù)防和治療流感。在新藥臨床應(yīng)用方面，2008 年澳大利亞Solagran 公司以針葉聚戊烯醇為原料，開發(fā)第一個聚戊烯醇新藥BIOACTIVER，應(yīng)用于肝疾病治療，在臨床上可治療早期Alzheimer(老年癡呆)癥和其它腦疾病。因此針葉聚戊烯醇不僅安全，而且在人體內(nèi)能夠改善細(xì)胞膜的流動性、穩(wěn)定性和滲透性，增強膜的融合，對于生物膜的結(jié)構(gòu)和功能具有明顯的調(diào)節(jié)作用。我們通過對比研究針葉聚戊烯醇和銀杏葉聚戊烯醇化學(xué)結(jié)構(gòu)及含量［22，23］，結(jié)果表明銀杏葉聚戊烯醇和針葉聚戊烯醇結(jié)構(gòu)相似，均為樺木醇結(jié)構(gòu)，并且異戊烯基單元數(shù)接近，尤其是聚戊烯醇在銀杏葉中的含量最高，約為1.0%～2.0%，是人體臟器中多萜醇含量的100 倍，因此，銀杏葉聚戊烯醇是多萜醇的理想原料。

目前國際上對銀杏葉及其提取物中銀杏黃酮、萜內(nèi)酯、銀杏酸、多糖等活性組分的化學(xué)、藥理、臨床及其制劑開發(fā)進行了深入系統(tǒng)的研究，而銀杏葉聚戊烯醇類脂是銀杏葉中新的有效成分，具有明顯的生物活性。本研究通過Ames 試驗、體外小鼠睪丸初級精母細(xì)胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗，結(jié)果表明銀杏葉聚戊烯醇屬無毒級，對小鼠體、臟器系數(shù)和血液生理生化指標(biāo)沒有影響，對小鼠睪丸初級精母細(xì)胞染色體無誘變活性，對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞的無致微核作用，在加與不加S9 的條件下，TA97、TA98、TA100、TA102 的自發(fā)回變菌落數(shù)均在正常范圍內(nèi)，銀杏葉聚戊烯醇對標(biāo)準(zhǔn)測試菌TA97、TA98、TA100 和TA102 均未檢出明顯的誘變活性。因此，銀杏葉聚戊烯醇無毒、無致癌、無致畸和無突變作用，GBP 在最大給藥量(21.5 g/kg)不影響小鼠的生化指標(biāo)和臟器系數(shù)及肝體比、腎體比、心體比、脾體比，因此，GBP 未見毒性，為GBP 保健食品和新藥的開發(fā)提供安全理論依據(jù)。

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