樟屬植物葉水浸提液對(duì)油樟懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響

李 群，譚韻雅，魏 琴，汪 超，游 玲

1四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610101;2宜賓學(xué)院香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜賓 644000

植物體內(nèi)各種次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生或增加主要通過(guò)各種生物或非生物因子誘導(dǎo)子調(diào)節(jié)代謝途徑、中間產(chǎn)物及關(guān)鍵酶活性等方式實(shí)現(xiàn)［1］。這些生物因子可能是植物激素物質(zhì)［2］，也可能是目標(biāo)代謝產(chǎn)物前體物質(zhì)［3，4］。將前體物質(zhì)作為誘導(dǎo)劑的前提是明確該目標(biāo)產(chǎn)物的生物合成途徑。雖然明確生物合成途徑的次生代謝產(chǎn)物并不多，但前提物質(zhì)一定是以中間代謝產(chǎn)物的形式存在于產(chǎn)生這些代謝產(chǎn)物的植物體內(nèi)，甚至于有相近化學(xué)成分的近緣植物體內(nèi)。目前在植物次生代謝產(chǎn)物積累方面，研究較多的是生物誘導(dǎo)子中的真菌誘導(dǎo)子［5-7］。而利用植物體本身或近緣種提取液作為誘導(dǎo)子的研究不多。王平等［8］研究表明，天竺桂水提液可促進(jìn)油樟葉懸浮細(xì)胞黃酮類物質(zhì)積累。天竺桂與油樟為同屬植物，這可能與天竺桂水提液中存在黃酮類物質(zhì)誘導(dǎo)因子有關(guān)。

油樟(Cinnamomum longepaniculatum N.Chao ex H.W.Li.)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木，為重要的經(jīng)濟(jì)作物，其根、莖、葉、種子均可提芳香油。油樟葉中提取的芳香油主要成分為萜類物質(zhì)，占芳香油85%以上［8］，其中已報(bào)道有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的成分有1，8-桉葉油素、r-松油烯、a-松油醇等［9-14］。油樟是中國(guó)特有天然香料。油樟主要分布于四川宜賓，目前資源不足30 萬(wàn)畝，所產(chǎn)油樟油遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。探討油樟油及其組分產(chǎn)生的影響因子及相關(guān)基礎(chǔ)研究，有利于進(jìn)一步充分利用油樟資源。本課題組前期分析檢測(cè)了油樟、大葉樟、香樟和天竺桂4 種樟屬植物葉水浸提液揮發(fā)性物質(zhì)組成成分情況，這些成分有共有性和物種特征性［15］。油樟油主成分1，8-桉葉油素的分子結(jié)構(gòu)中含有氧雜二環(huán)，推測(cè)其前提物質(zhì)可能為水溶性的。天竺桂等其它近緣種是否對(duì)油樟揮發(fā)性物質(zhì)的積累產(chǎn)生促進(jìn)作用，這方面的研究未見報(bào)道。以此為出發(fā)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)將4 種樟屬植物油樟(Cinnamomum longepaniculatum N.Chao ex H.W.Li.)、大葉樟(Cinnamomum parthenoxylum)、香樟(Cinnamomum camphora)、天竺桂(Cinnamomum japonicum Sieb.)葉水浸提液添加到油樟懸浮培養(yǎng)系中，研究其水浸提液對(duì)油樟懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)及揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物的影響，旨在初步探究油樟近緣種中是否存在有利于油樟揮發(fā)性物質(zhì)積累的物質(zhì)，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

油樟(Cinnamomum longepaniculatum N.Chao ex H.W.Li.)、大葉樟(Cinnamomum parthenoxylum)、香樟(Cinnamomum camphora)、天竺桂(Cinnamomum japonicum Sieb.)的葉片采自宜賓學(xué)院校園內(nèi)，由宜賓學(xué)院魏琴教授鑒定;1，8-桉葉油素(0.5 mL/支，HPLC≥99%)、α-松油醇(0.1 g/支，98%)和γ-松油烯(1 g/支，GC95%)三種標(biāo)品在北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司購(gòu)回。

1.2 儀器

氣相色譜儀［Agilent7890A、氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)］。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 油樟懸浮細(xì)胞系的建立

參照魏琴等［16］的配方進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基配方是B5 +0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH5.8。將愈傷組織(約2 g鮮重)轉(zhuǎn)移到含40 mL 液體的培養(yǎng)基100 mL 錐形瓶中懸浮培養(yǎng)，每20 d 繼代一次，搖床轉(zhuǎn)速110 r/min，25 ℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃。每三周繼代一次，連續(xù)繼代三次，直至愈傷組織較為疏松后用于建立懸浮培養(yǎng)體系。

1.3.2 樟屬植物葉水浸提液制備

采摘新鮮的油樟、大葉樟、香樟和天竺桂葉片洗凈，晾干，稱取40 g 放入打漿機(jī)中加入適量蒸餾水打2 min，用四層紗布過(guò)濾，濾液定容至1 L 就獲得濃度為40 g/L 的水提液。121 ℃高壓滅菌20 min后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 1，8-桉葉油素、γ-松油烯和α-松油醇3 種物質(zhì)混和標(biāo)樣的制備與檢測(cè)

稱取0.5 g 1，8-桉葉油素、γ-松油烯和α-松油醇標(biāo)品，分別置于50 mL 容量瓶中用乙醇定容，制成10 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取配好的10 g/L 的3 種標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋配制成濃度為0.1mg/L 的混和標(biāo)樣。取10 mL 培養(yǎng)物頂空進(jìn)樣，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。

1.3.4 樟屬植物葉浸提液對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和揮發(fā)性物質(zhì)積累的影響

在懸浮培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.1%(100 mL 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基中添加0.1 mL 樟屬植物葉浸提液，以下同)、0.25%、1%、4%、10%的4 種樟屬植物葉浸提液，搖床轉(zhuǎn)速110 rpm，25 ℃條件下培養(yǎng)，以未加浸提液的實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)照，每組重復(fù)3 瓶，培養(yǎng)20 d。取10 mL 培養(yǎng)物(細(xì)胞加培養(yǎng)液)頂空進(jìn)樣，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)，以1，8-桉葉油素、a-松油醇和r-松油烯三種標(biāo)品制作混標(biāo)，用與樣品相同的方法進(jìn)樣，用以對(duì)樣品中產(chǎn)物進(jìn)行定性檢測(cè)。每組重復(fù)3次。

1.3.4.1 生物量的測(cè)定

將懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物抽濾，取細(xì)胞，置于烘箱中45 ℃干燥至恒重，稱其質(zhì)量為細(xì)胞干重。每組重復(fù)3 次。

1.3.4.2 GC-FID 條件

HP-5(30 m×320 μm ×0.25 μm)毛細(xì)管柱，平衡溫度95 ℃，平衡時(shí)間20 min。載氣為氮?dú)猓瑲錃饬魉?0 mL/min，空氣流速400 mL/min，氮?dú)馕泊禋?5 mL/min，頂空進(jìn)樣，分流比3.0。柱箱程序:90 ℃保持4 min，然后20 ℃/min 到130 ℃保持5 min，然后20 ℃/min 到190 ℃保持1 min，然后20 ℃/min到240 ℃保持1 min。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

以峰面積表示各物質(zhì)的產(chǎn)量，其中總揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物以總峰面積表示。試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤即()表示。

1.3.6 方法學(xué)考察

1.3.6.1 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1.3.3 中配制好的0.1 mg/L 的混標(biāo)，取10 mL 于頂空進(jìn)樣瓶中，按1.3.4.2 方法重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算1，8-桉葉油素、r-松油烯、a-松油醇及總峰面積的峰面積RSD(%)分別為1.92、1.04、1.20、1.66;取同一供試品在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5 次，并連續(xù)進(jìn)樣3 d，計(jì)算1，8-桉葉油素、r-松油烯、a-松油醇及總峰面積的峰面積日內(nèi)與日間RSD(%)分別為1.83、1.78、1.90、1.36。

1.3.6.2 回收率試驗(yàn)

取1.3.3 中配制好的10 g/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水為溶劑配制成1、0.5、0.1 mg/L 的混標(biāo)，分別取5 mL 于頂空進(jìn)樣瓶中，再分別加入5 mL 已測(cè)樣品，依1.3.4.2 中方法測(cè)定，計(jì)算出1，8-桉葉油素、r-松油烯、a-松油醇及總峰面積的峰面積回收率分別為100.11%、99.36%、100.04%、100.10%、99.45%，RSD(%)分別為1.55、1.89、1.28、1.88。

以上方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所用方法可靠。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 混合標(biāo)樣GC-FID 分析

由混合標(biāo)品的氣相色譜檢測(cè)結(jié)果可知(圖1A)，1，8-桉葉油素、a-松油醇和γ-松油烯的出峰時(shí)間分別為2.840、3.167 和5.325 min。樣品中(圖1B)相同的出峰時(shí)間被認(rèn)為是與標(biāo)品相同的物質(zhì)。

圖1 混合標(biāo)樣(A)和樣品(B)GC-FID 總離子流圖Fig.1 GC-FID chromatograms of mix standard (A)and sample (B)

2.2 4 種樟屬植物葉水浸提液對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

樟屬植物葉浸提液對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響見圖2。經(jīng)方差分析得知4 種樟屬植物葉水浸提液試驗(yàn)組中的細(xì)胞干重與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明4 種水提液誘導(dǎo)子對(duì)油樟細(xì)胞生長(zhǎng)既無(wú)明顯地促進(jìn)作用也無(wú)明顯地抑制作用。

圖2 樟屬植物提取物處理后懸浮細(xì)胞的生物量(g/L)Fig.2 The biomass of suspension cell after processed by Cinnamomum plant extracts (g/L)

2.3 4 種樟屬植物葉水浸提液對(duì)次生代謝產(chǎn)物積累總量的影響

4 種樟屬植物葉水浸提液對(duì)次生代謝產(chǎn)物積累總量的影響見圖3。經(jīng)方差分析得知，絕大部分試驗(yàn)組和對(duì)照組相比差異顯著。天竺桂與香樟水提液誘導(dǎo)子對(duì)次生代謝產(chǎn)物積累總量均呈低濃度促進(jìn)高濃度抑制的作用效果，水浸提液添加量分別為4%和1%時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)，其總峰面積分別為空白對(duì)照組的1.78 和1.45 倍。大葉樟和油樟水提液對(duì)次生代謝產(chǎn)物積累總量均呈抑制作用，且隨著濃度的增加其抑制作用越強(qiáng)。

圖3 樟屬植物提取物處理后懸浮細(xì)胞中總揮發(fā)性物質(zhì)積累量(總峰面積/pA)Fig.3 The accumulation of total volatile substances in suspension cell after processed by Cinnamomum plant extracts (total peak area/pA)

2.4 4 種樟屬植物葉水浸提液對(duì)3 種萜類物質(zhì)積累的影響

4 種樟屬植物葉水浸提液對(duì)懸浮細(xì)胞3 種萜類物質(zhì)積累的影響見圖4。不同樟屬植物葉水浸提液對(duì)3 種萜類物質(zhì)積累的影響不同。

對(duì)于1，8-桉葉油素的積累，僅天竺桂水提液誘導(dǎo)子試驗(yàn)組對(duì)1，8-桉葉油素積累呈低濃度促進(jìn)高濃度抑制的影響，且在添加量為1%時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)，1，8-桉葉油素峰面積為空白對(duì)照組的1.46 倍，其余幾種誘導(dǎo)子在所設(shè)試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)其均呈抑制作用，且濃度越高其抑制作用越強(qiáng)。

對(duì)于γ-松油烯的積累，4 種水提液誘導(dǎo)子在所設(shè)試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)松油烯積累均呈促進(jìn)作用，其中大葉樟、天竺桂和香樟水提液均在添加量為1%時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)，此時(shí)γ-松油烯峰面積分別為0.39、0.27 和0.32 pA，油樟水提液在添加量為4%時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)，此時(shí)γ-松油烯峰面積為0.27 pA。

對(duì)于α-松油醇的積累，天竺桂和香樟葉水浸提液對(duì)α-松油醇積累呈低濃度促進(jìn)高濃度抑制的影響，且均是在濃度為0.25%時(shí)促進(jìn)作用最強(qiáng)，此時(shí)α-松油醇峰面積分別為空白對(duì)照組1.62 和1.24倍，而大葉樟水提液對(duì)α-松油醇積累均呈抑制作用，且濃度越高其抑制作用就越強(qiáng)。

圖4 樟屬植物提取物處理后懸浮細(xì)胞中3 種萜類化合物積累量(峰面積/pA)Fig.4 The accumulation of 3 terpenoids in suspension cell after processed by Cinnamomum plant extracts (Peak area/pA)

3 討論

4 種樟屬植物葉水浸提液添加至懸浮細(xì)胞系后，細(xì)胞生長(zhǎng)量未受太大的影響(圖2)，該措施保證了懸浮細(xì)胞的生物量。對(duì)于以收集次生代謝產(chǎn)物為目的的研究或生產(chǎn)有積極意義。

不同樟屬植物葉水浸提液添加至懸浮細(xì)胞系后，對(duì)揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物積累總量及3 種組分影響均不同(圖3、圖4)。這與這幾種植物葉水浸提液成分差異有密切關(guān)系［15］。本研究因?yàn)槭軜?biāo)品限制，僅檢測(cè)了目前開發(fā)利用價(jià)值較高、有標(biāo)品的3 種萜類物質(zhì)。4 種葉水浸提液對(duì)γ-松油烯均有促進(jìn)作用，且是從無(wú)到有的誘導(dǎo)(對(duì)照中無(wú))，這是否與4種葉水浸提液均含有2，2＇-亞甲基雙［6-(1，1-雙甲基乙基)-4-甲基］苯酚這個(gè)特征性化合物有關(guān)，有待進(jìn)一步研究;對(duì)于1，8-桉葉油素的積累，僅天竺桂水提液有積極的誘導(dǎo)促進(jìn)作用，這是否與天竺桂葉水浸提液中獨(dú)特而含量較高(91.82%)的順式-四氫化-2，5-二甲基-呋喃有關(guān)，有待進(jìn)一步研究;天竺桂和香樟能促進(jìn)α-松油醇的積累，這是否與二者的葉水浸提液中共同含有的1，2-苯二羧酸丁基(2-甲基丙基)酯、1，2-苯二羧酸單(2-乙基己基)酯、1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1，4-環(huán)已二烯、2，2＇-亞甲基雙［6-(1，1-雙甲基乙基)-4-甲基］苯酚及三乙酸甘油酯有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。這些代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)也可能是多種成分共同作用的結(jié)果。

由于本實(shí)驗(yàn)中所加葉水浸提液含有與所測(cè)產(chǎn)物相同的物質(zhì)，在表示產(chǎn)物的積累時(shí)減去了誘導(dǎo)子中原本含有的含量，因此部分產(chǎn)物積累量為負(fù)值(圖3、圖4)。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看出，在高濃度條件下，其次生代謝產(chǎn)物峰面積降低或大多均為負(fù)值，這說(shuō)明在高濃度葉水浸提液作用下，油樟細(xì)胞可能會(huì)消耗誘導(dǎo)子中的某些物質(zhì)，也許被當(dāng)做碳源用于細(xì)胞的生長(zhǎng)，也許被轉(zhuǎn)化為其它的不具有揮發(fā)性或者揮發(fā)性差的物質(zhì)，也可能因?yàn)槿~浸提液中目標(biāo)代謝產(chǎn)物的存在，反饋抑制導(dǎo)致含量下降。

在本研究中，所有對(duì)次生代謝產(chǎn)物有促進(jìn)作用的試驗(yàn)組，其誘導(dǎo)促進(jìn)強(qiáng)度均不高，未超過(guò)對(duì)照的2倍(圖3、圖4)，這可能跟采葉的季節(jié)、時(shí)間有關(guān)，也與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件有關(guān)，有待進(jìn)一步篩選條件。朱娜等［17］提到誘導(dǎo)子具有專一性、快速性、濃度效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)以及協(xié)同效應(yīng)。本研究?jī)H討論了濃度效應(yīng)，專一性、時(shí)間效應(yīng)及協(xié)同效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

本研究首次報(bào)道了以上幾種樟屬植物提取物誘導(dǎo)子對(duì)油樟懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中揮發(fā)性產(chǎn)物積累的作用，為利用油樟細(xì)胞生產(chǎn)一些有用次生代謝產(chǎn)物提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 Fang HY(房慧勇)，Zhu H(朱虹)，Ding HM(丁海麥)，et al.Research progress on effect factors of secondary metabolites content in callus.China J Chin Mater Med(中國(guó)中藥雜志)，2014，39:2846-2850.

2 Gu YH(谷榮輝)，Hong LY(洪利亞)，Long CL(龍春林).The ways of producing secondary metabolites via plant cell culture.Plant Physiol J(植物生理學(xué)報(bào))，2013，49:869-881.

3 Liu R(劉冉)，Wang ZY(王振宇)，Cui J(崔杰)，et al.Effects of precursors and elicitations on the synthesis polyphenols of Pinus koraiensis.J Beijing Forest Univ(北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2013，35(5):22-27.

4 Dong LM(董樂(lè)萌)，Wei JH(魏建和)，Liu YJ(劉玉軍)，et al.Advances in studies on spatial-specific distributions of secondary metabolites and related enzymes in plants.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2009，40:153-155.

5 Xu MJ，Dong JF，Wang HZ，et al.Complementary action of jasmonic acid on salicylic acid in mediating fungal elicitorinduced flavonol glycoside accumulation of Ginkgo biloba cells.Plant Cell Environ，2009，32:960-967.

6 Pawar KD，Yadav AV，Shouche YS，et al.Influence of endophytic fungal elicitation on production of inophyllum in suspension cultures of Calophyllum inophyllum L.Plant Cell Tiss Org，2011，106:345-352.

7 Tan Y(譚燕)，Ja R(賈茹)，Tao JH(陶金華)，et al.Regulation on biosynthesis of active constituents in medicinal plants by endophytic fungal elicitor.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2013，44:2004-2008.

8 Wang P(王平)，Zhang P(張萍)，Hou M(侯茂)，et al.Effects of Cinnamomum japonicum Sieb.water extracts on the flavonoids accumulation in cell suspension culture of Cinnamomum longepaniculatum N.Chao ex H.W.Li.Bull Biol(生物學(xué)通報(bào))，2012，47(10):39-40.

9 Hu WJ(胡文杰)，Gao HD(高捍東)，Jang XM(江香梅)，et al.Analysis on constituents and contents in leaf essential oil from three chemical types of Cinnamum camphora.J Cent South Univ For Tech(中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào))，2012，32:186-194.

10 Li L，Li ZW，Yin ZQ，et al.Antibacterial activity of leaf essential oil and its constituents from Cinnamomum longepaniculatum.Int J Clin Exp Med，2014，7:1721-1727.

11 Xu S，Yin ZQ，Wei Q，et al.Anti-hepatoma effect of safrole from Cinnamomum longepaniculatum leaf essential oil in vitro.Int J Clin Exp Pathol，2014，7:2265-2272.

12 Ye KC(葉奎川)，Yin ZQ(殷中瓊)，Wei Q(魏琴)，et al.Anticancer activity of the essential oil from Cinnamomum longepaniculatum leaves and its major components against human BEL-7402.Acta Anat Sin(解剖學(xué)報(bào))，2012，43:381-385.

13 Shi CF(石超峰)，Yin ZQ(殷中瓊)，Wei Q(魏琴)，et al.Bacteriostatic action and mechanism of α-terpineol on Escherichia coli.Acta Vet Zootech Sin(畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào))，2013，44:796-801.

14 Huang D(黃彤)，You L(游玲)，et al.Inhibiting effects of by-products from Cinnamommum longepaniculatum oil on pathogenic bacteria causing skin infection.J Sichuan Agric Univ(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào))，2014，32:53-58.

15 Wei Q(魏琴)，Tan YY(譚韻雅)，Li Q(李群)，et al.GCMS analysis of five kinds of cinnamomum plant leaf water leaching solution.J Sichuan Univ，Nat Sci(四川大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2015，52:193-198.

16 Wei Q(魏琴)，Wang L(王麗)，F(xiàn)u TH(傅體華)，et al.Studies of cell suspension culture and induction of secondary metabolism products in Cinnamomum longepaniculatum.Chin Bull Bot(植物學(xué)通報(bào))，2008，5:591-596.

17 Zhu N(朱娜)，Zhou YQ(周宇瓊).Application of elicitor on medicinal plant cultivation.Mod Agric Sci Technol(現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技)，2011，24:52-53.