雪松松針總黃酮醇提工藝優(yōu)化

冉維廣+薛長(zhǎng)暉+姚文紅

摘要：利用乙醇浸提法提取雪松松針中的黃酮類化合物，以蘆丁為對(duì)照品，采用NaAc-AlCl3比色法考察總黃酮提取率，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，該方法的最佳提取工藝為：以1 g松針為原料，按照1∶45的料液比加入50%乙醇作為提取劑，于75℃恒溫回流提取2 h。最佳工藝條件下雪松松針的總黃酮提取率為3.64%，RSD為4.04%。該方法穩(wěn)定可靠，工藝合理可行。

關(guān)鍵詞：雪松松針；總黃酮；分光光度法；工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S789.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）09-0120-04

松針富含多種營(yíng)養(yǎng)成分[1]，具有解毒、提高人體免疫力等作用，在醫(yī)藥、衛(wèi)生保健等方面存在巨大的開發(fā)利用價(jià)值[2，3]。目前，對(duì)雪松松針的研究主要集中在對(duì)其揮發(fā)油類、黃酮類成分的分析上[4]，缺乏對(duì)其提取工藝的系統(tǒng)研究。本試驗(yàn)著重對(duì)雪松松針中總黃酮的最佳提取工藝進(jìn)行研究，以期為雪松松針總黃酮的大規(guī)模提取及其產(chǎn)品的深加工提供可行性依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

雪松松針，采自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海鼎杰生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、結(jié)晶三氯化鋁、乙酸鈉、60～90℃石油醚等，均為分析純。

UV-1601型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；AR1140電子天平，上海奧斯豪國(guó)際工貿(mào)公司；KDM電子調(diào)溫電熱套，龍口市先科儀器公司；雙列六孔電熱恒溫水浴鍋，龍口市先科儀器公司；C30孔玻璃儀器氣流烘干器， 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SHB-B88循環(huán)水式真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1松針樣品的前處理由于葉綠素等油溶性雜質(zhì)易溶于石油醚[5]，而黃酮不溶于石油醚[6]，因此本試驗(yàn)采用石油醚浸提法對(duì)松針樣品進(jìn)行前處理，以除去葉綠素等油溶性雜質(zhì)。

1.2.2提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)，依次對(duì)乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行試驗(yàn)，以確定各因素最優(yōu)值。在此基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的工藝優(yōu)化。

1.2.3總黃酮提取率的測(cè)定①標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：天然產(chǎn)物中總黃酮含量的測(cè)定通常是以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)紫外可見分光光度法進(jìn)行的[7]。本試驗(yàn)以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法為：準(zhǔn)確移取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、5.00 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL容量瓶，加入70%乙醇10.00 mL稀釋，準(zhǔn)確移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度搖勻，顯色25 min，于282 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（C）對(duì)吸光度（A）進(jìn)行線性回歸，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.0068+28.66724×C，R=0.9998，線性關(guān)系良好（見圖1）。

②松針樣品總黃酮的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取1 g松針待測(cè)樣于250 mL燒瓶中，回流提取，冷卻30 min，過(guò)濾，濾液定容至100 mL容量瓶。按照上述方法測(cè)定吸光度，根據(jù)公式求得總黃酮提取率。

2結(jié)果與分析

2.1松針樣品前處理效果

由圖2可以看出，經(jīng)石油醚浸提后的吸收曲線（B）更加平緩，雜質(zhì)峰明顯減少，低波長(zhǎng)處吸收峰的覆蓋率降低，282 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，

峰型平緩，表明石油醚浸提除雜效果顯著。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響控制體系溫度為75℃、料液比為1∶35、提取時(shí)間為3 h，設(shè)置不同的乙醇濃度對(duì)雪松松針中總黃酮進(jìn)行提取，結(jié)果（圖3）顯示，隨著乙醇濃度的增大，提取率先升高后降低，乙醇濃度為50%時(shí)提取率最高。因此，選取乙醇濃度40%、50%、60%三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.2浸提溫度對(duì)總黃酮提取率的影響控制料液比為1∶35、提取時(shí)間3 h、乙醇濃度70%，設(shè)置不同的體系溫度回流提取雪松松針中的總黃酮，結(jié)果（圖4）表明，隨著溫度的升高，提取率逐漸升高至85℃時(shí)提取率最高，后略有降低。天然產(chǎn)物的提取過(guò)程中，溫度對(duì)提取效果的影響較為復(fù)雜。松針中含有較多種類的活性物質(zhì)，在不同溫度下，會(huì)發(fā)生一些化學(xué)反應(yīng)而降低黃酮含量[8]。較高的溫度不但容易導(dǎo)致部分黃酮的分解[9]，而且不符合低能耗的原則，因此，選擇 65、75、85℃為正交試驗(yàn)提取溫度的三個(gè)水平。

2.2.3料液比對(duì)總黃酮提取率的影響控制體系溫度為75℃、提取時(shí)間為3 h、乙醇濃度為70%，設(shè)置不同的料液比回流提取雪松松針中的總黃酮，結(jié)果（圖5）表明，料液比為1∶45時(shí)總黃酮提取率最高。因此，選取1∶25、1∶35、1∶45為正交試驗(yàn)料液比的三個(gè)水平。

2.2.4提取時(shí)間對(duì)提取率的影響控制體系溫度為75℃、乙醇濃度為70%、料液比為1∶35，改變松針中總黃酮的浸提時(shí)間，結(jié)果（圖6）表明，回流提取時(shí)間為3 h時(shí)，黃酮提取率最高。因此，選取2、3、4 h為正交試驗(yàn)提取時(shí)間的三個(gè)水平。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，研究浸提溫度、提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度對(duì)雪松松針中總黃酮提取率的影響，結(jié)果（表1）顯示，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響順序是：浸提溫度>料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間；各因素最優(yōu)組合為：浸提溫度75℃，料液比1∶45，乙醇濃度50%，提取時(shí)間3～4 h。因提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響最小，且提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不僅會(huì)影響黃酮的穩(wěn)定性，還會(huì)降低其提取效率，為節(jié)能降耗、提高效率，最終確定提取時(shí)間為2 h。

綜上所述，雪松松針中總黃酮提取的最佳工藝條件為：浸提溫度75℃，料液比1∶45，乙醇濃度50%，提取時(shí)間2 h。endprint

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g松針待測(cè)樣，置于250 mL燒瓶中，加入50%的乙醇45 mL，于75℃恒溫水浴回流提取2 h，冷卻30 min后過(guò)濾至100 mL容量瓶中，定容，得待測(cè)液。取2.00 mL待測(cè)液于25 mL容量瓶中，加入70 %的乙醇10.00 mL稀釋，準(zhǔn)確移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，顯色25 min，于282 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果（表2） 表明，平均提取率為3.64%。雖與提取3～4 h相比，總黃酮提取率有所降低，但縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率，降低了能耗，優(yōu)化后的工藝條件有效可行。

3小結(jié)

本試驗(yàn)采用紫外分光光度法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以乙醇水溶液為提取劑，采用溶劑回流浸提法提取雪松松針中的總黃酮，并通過(guò)AlCl3-NaAc顯色體系，在282 nm波長(zhǎng)下測(cè)定總黃酮提取率。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了最佳提取工藝為：1 g雪松松針待測(cè)樣，按照1∶45的料液比，加入50%乙醇為提取劑，保持溫度為75℃回流提取2 h，所得總黃酮提取率為3.64%，RSD 4.04%。該提取工藝方法簡(jiǎn)單可行，效果穩(wěn)定可靠。

參考文獻(xiàn)：

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[9]李倩，鐘玲，池汝安，等. 離子液體微波輔助提取葛根總黃酮[J]. 武漢工程大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 33 （11）：31-34.endprint

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g松針待測(cè)樣，置于250 mL燒瓶中，加入50%的乙醇45 mL，于75℃恒溫水浴回流提取2 h，冷卻30 min后過(guò)濾至100 mL容量瓶中，定容，得待測(cè)液。取2.00 mL待測(cè)液于25 mL容量瓶中，加入70 %的乙醇10.00 mL稀釋，準(zhǔn)確移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，顯色25 min，于282 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果（表2） 表明，平均提取率為3.64%。雖與提取3～4 h相比，總黃酮提取率有所降低，但縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率，降低了能耗，優(yōu)化后的工藝條件有效可行。

3小結(jié)

本試驗(yàn)采用紫外分光光度法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以乙醇水溶液為提取劑，采用溶劑回流浸提法提取雪松松針中的總黃酮，并通過(guò)AlCl3-NaAc顯色體系，在282 nm波長(zhǎng)下測(cè)定總黃酮提取率。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了最佳提取工藝為：1 g雪松松針待測(cè)樣，按照1∶45的料液比，加入50%乙醇為提取劑，保持溫度為75℃回流提取2 h，所得總黃酮提取率為3.64%，RSD 4.04%。該提取工藝方法簡(jiǎn)單可行，效果穩(wěn)定可靠。

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2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g松針待測(cè)樣，置于250 mL燒瓶中，加入50%的乙醇45 mL，于75℃恒溫水浴回流提取2 h，冷卻30 min后過(guò)濾至100 mL容量瓶中，定容，得待測(cè)液。取2.00 mL待測(cè)液于25 mL容量瓶中，加入70 %的乙醇10.00 mL稀釋，準(zhǔn)確移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，顯色25 min，于282 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果（表2） 表明，平均提取率為3.64%。雖與提取3～4 h相比，總黃酮提取率有所降低，但縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率，降低了能耗，優(yōu)化后的工藝條件有效可行。

3小結(jié)

本試驗(yàn)采用紫外分光光度法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，以乙醇水溶液為提取劑，采用溶劑回流浸提法提取雪松松針中的總黃酮，并通過(guò)AlCl3-NaAc顯色體系，在282 nm波長(zhǎng)下測(cè)定總黃酮提取率。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了最佳提取工藝為：1 g雪松松針待測(cè)樣，按照1∶45的料液比，加入50%乙醇為提取劑，保持溫度為75℃回流提取2 h，所得總黃酮提取率為3.64%，RSD 4.04%。該提取工藝方法簡(jiǎn)單可行，效果穩(wěn)定可靠。

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