新型鹵代醇脫鹵酶基因的克隆、序列分析及表達(dá)

馮 峰， 胡 蝶， 余 濤， 曾 妍， 鄔敏辰

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

新型鹵代醇脫鹵酶基因的克隆、序列分析及表達(dá)

馮 峰1， 胡 蝶2， 余 濤1， 曾 妍1， 鄔敏辰*3

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué) 無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

鹵代醇脫鹵酶可以催化合成具有光學(xué)純的環(huán)氧化物及β-取代醇等高價(jià)值手性藥物中間體。作者所在實(shí)驗(yàn)室利用宏基因組技術(shù)從無(wú)錫新區(qū)工業(yè)集中地污染土壤中篩選了一段編碼基因Y，經(jīng)測(cè)序知其片段包含有765 bp的核苷酸，編碼254個(gè)氨基酸。經(jīng)Blast軟件分析，其氨基酸序列與來(lái)自根癌土壤桿菌 （Agrobacterium tumefaciens）的鹵代醇脫鹵酶HheC同源性為81%，且含有鹵代醇脫鹵酶類(lèi)的保守催化三聯(lián)體Ser132-Thr145-Arg149。推測(cè)其屬于鹵代醇脫鹵酶HheC類(lèi)，命名為SyHheC。根據(jù)大腸桿菌Escherichia coli BL21的密碼子偏愛(ài)性，對(duì)基因Y進(jìn)行密碼子優(yōu)化和人工合成，命名為SyhheC，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SyhheC，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱親和層析后獲得電泳純的重組鹵代醇脫鹵酶reSyHheC。SDS-PAGE分析，reSyHheC的相對(duì)分子質(zhì)量為34 000。以2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇為底物，reSyHheC催化底物產(chǎn)生2-（4-硝基苯基）環(huán)氧乙烷的比活性為5.2 U/mg。

鹵代醇脫鹵酶；宏基因組技術(shù)；序列分析；密碼子優(yōu)化；表達(dá)

鹵 代 醇 脫 鹵 酶 （EC 4.5.1.-，Halohydrin dehalogenase，HHDH）是細(xì)菌降解環(huán)境中重要污染物有機(jī)鹵化物的關(guān)鍵酶之一，具有與其它已知脫鹵酶不同的脫鹵機(jī)制[1]。通過(guò)分子內(nèi)親核取代機(jī)制催化鄰鹵醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物和鹵化氫，是微生物降解重要的環(huán)境污染物有機(jī)鹵化物的關(guān)鍵酶之一。同時(shí)該酶在催化環(huán)氧化物的開(kāi)環(huán)反應(yīng)中，可高選擇性的催化接受如X-、N3-、NO2-、CN-等親核基團(tuán)，生成一系列光學(xué)純的β-取代醇，因而在手性藥物合成方面也有廣闊的應(yīng)用前景[2]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于產(chǎn)新酶菌株篩選的報(bào)道有底物篩選法、基因狩獵法和宏基因組技術(shù)等。底物篩選法具有工作量大、盲目性大等缺點(diǎn)；基因狩獵法雖有一定的優(yōu)勢(shì)，但卻不能對(duì)那些不可培養(yǎng)的微生物的基因組進(jìn)行運(yùn)用，而這些不可培養(yǎng)的微生物卻是新基因及新酶的重要來(lái)源；宏基因組技術(shù)通過(guò)直接從環(huán)境中提取全部微生物DNA，為后續(xù)的篩選提供更加全面的基因資源，增加了獲得新功能基因的機(jī)會(huì)[3-4]。如Michael Kotika等[5]利用宏基因組技術(shù)從土壤中挖掘出環(huán)氧化物水解酶 （epoxide hydrolases），因而是一種快速有效的挖掘新酶的方法。

利用宏基因組技術(shù)，作者從無(wú)錫新區(qū)工業(yè)集中區(qū)污染土壤中篩選出了一段編碼基因Y，經(jīng)送上海生工測(cè)序得知其序列，并通過(guò)同源比對(duì)方法分析其氨基酸序列，推測(cè)其為一種新型鹵代醇脫鹵酶（SyHheC）。對(duì)該酶的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化后經(jīng)人工合成并命名為SyhheC；將優(yōu)化基因與表達(dá)質(zhì)粒pET28a連接于大腸桿菌 Escherichia coli BL21（DE3）中表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析純化，獲得電泳純的重組鹵代醇脫鹵酶reSyHheC，以2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇為底物，測(cè)定reSyHheC的酶活力。本研究為該新型鹵代醇脫鹵酶的深入研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其它新酶基因的開(kāi)發(fā)提供了新的策略。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

大腸桿菌E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）和表達(dá)質(zhì)粒pET28a：Invitrogen公司；質(zhì)粒pUCm-T：上海Sangon公司；LB培養(yǎng)基：1 g/dL Tryptone、0.5 g/dL Yeast Extract、1 g/dL NaCl（固體培養(yǎng)基添加2 g/dL瓊脂）；富集培養(yǎng)基的配置參照文獻(xiàn)[6]。

1.2 主要試劑和儀器

250 bp DNA Ladder marker、低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker、rTaq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、各種限制性?xún)?nèi)切酶：大連TaKaRa公司；2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇、1，3-二氯-二丙醇 （1，3-DCP）、N，N-二甲基甲酰胺、鹽酸半胱氨酸、K2HPO4和KH2PO4等其它試劑：國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純；快速DNA提取檢測(cè)試劑盒 （KG203）：天根生化科技 （北京）有限公司；一站式His標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化套裝：北京天恩澤基因科技有限公司；戴安UltiMate-3000高效液相色譜儀：戴安 （中國(guó)）有限公司：ZW&A-C18反相色譜柱：科奧美萃生物科技公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

用于驗(yàn)證宏基因組中是否含有鹵代醇脫鹵酶基因，其簡(jiǎn)并引物GB1，MB1的設(shè)計(jì)參照湯麗霞[7]等方法。根據(jù)已知的來(lái)自根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的鹵代醇脫鹵酶HheC（序列號(hào)：AF397296）[1]，結(jié)合生物信息學(xué)分析的手段，設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性的上下游引物T2-F，T2-R，見(jiàn)表1。

1.4 鹵代醇脫鹵酶基因的克隆

土壤DNA提取參照Knietsch[7]等的方法進(jìn)行。分別取2 g樣品加入20 mL富集培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)1 d；1 000 r/min離心10 min，收集上清液，當(dāng)菌體OD600值為0.2～0.4時(shí)，10 000 r/min離心20 min收集菌體；得到的菌體加入20 mL不含酵母提取物的富集培養(yǎng)基中，含有10 mmol/L 1，3-DCP作為惟一碳源，30℃、180 r/min培養(yǎng)4 d，每天檢測(cè)菌體濃度；收集菌體，用細(xì)菌基因組提取試劑盒（KG203）提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。以提取的?xì)菌DNA為模板，GB1，MB2為引物按如下條件進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、割膠回收、與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，送上海Sangon公司測(cè)序。以提取的細(xì)菌DNA為模板，T2-F，T2-R為引物按如下條件進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、割膠回收、與pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，送上海Sangon公司測(cè)序，將獲得的基因命名為Y。

1.5 基因Y編碼的氨基酸序列分析

利用DNAMAN 6.0軟件將獲得的基因Y翻譯成氨基酸序列。用NCBI中的Blast在線(xiàn)工具和DNAMAN 6.0進(jìn)行氨基酸序列同源性分析[8]。

1.6 鹵代醇脫鹵酶（SyHheC）基因的密碼子優(yōu)化

根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)基因Y進(jìn)行密碼子優(yōu)化和人工合成[9]，同時(shí)在目的基因兩端分別加NcoⅠ和NotⅠ限制性酶切位點(diǎn)，在5'端添加組氨酸標(biāo)簽，并命名為SyhheC。優(yōu)化后的基因由上海Sangon公司合成并與pUCm-T連接，獲得重組質(zhì)粒pUCm-TSyhheC。

1.7 鹵代醇脫鹵酶重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

分別用限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ和NotⅠ雙酶酶切質(zhì)粒pUCm-T-SyhheC和表達(dá)載體pET28a，回收目的基因片段和載體片段，以T4DNA連接酶于16℃連接16 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli BL21，接種于含卡那霉素（100 μg/mL）的LB培養(yǎng)板上，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落，接種于液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，利用T7引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，挑選陽(yáng)性重組子送上海Sangon公司測(cè)序。測(cè)序正確后命名該重組表達(dá)質(zhì)粒為pET28a-SyhheC。

1.8 鹵代醇脫鹵酶的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽(yáng)性菌株E.coli BL21/pET28a-SyhheC接種于含卡那霉素的2 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。取300 μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于30 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，向培養(yǎng)物中添加終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，于25℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，在4℃、8 000 r/min離心收集菌體[10]。以pET28a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli BL21菌株在同樣條件培養(yǎng)作為陰性對(duì)照，表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.9 重組鹵代醇脫鹵酶（reSyHheC）的純化

將離心收集的重組菌 E.coli BL21/pET28a-SyhheC懸浮于0.1 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH 7.0）中進(jìn)行超聲破碎。破碎條件：工作4 s，間隔6 s，工作時(shí)間10 min。超聲破碎后16 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。將粗酶液經(jīng)微孔濾膜 （0.45 μm）過(guò)濾后上樣至預(yù)先用100 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液 （pH 7.0）平衡的1 mL鎳離子親合層析柱，結(jié)合 30 min后用 100 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH 7.0）配置成200 mmol/L的咪唑液洗脫，獲得目的重組鹵代醇脫鹵酶（reSyHheC），全部純化步驟在4℃下進(jìn)行。純化reSyHheC經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定使用Bradford法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。

1.10 reSyHheC酶活力的測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定reSyHheC酶活力[11]。取100 μL、100 mmol/L的2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇 （DMF配置）于1.5 mL EP管中，再加入800 μL、pH 7.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。于40℃預(yù)熱5 min，加入100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，40℃下反應(yīng)8 min。吸取200 μL反應(yīng)液加入800 μL甲醇終止反應(yīng)，立即混勻進(jìn)行高效液相色譜 （HPLC）分析。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol 2-（4-硝基苯基）環(huán)氧乙烷所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位（U）。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹵代醇脫鹵酶基因的克隆

以提取的細(xì)菌DNA為模板，GB1、MB2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約520 bp處有一條明顯的條帶，見(jiàn)圖1（泳道1），這與理論上簡(jiǎn)并引物GB1，MB2對(duì)來(lái)自根癌土壤桿菌（A.tumefaciens）的鹵代醇脫鹵酶 （HheC）基因PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度相符，割膠回收產(chǎn)物連接至pUCm-T，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序獲得512 bp DNA序列，經(jīng)Blast同源性分析，該序列與根癌土壤桿菌的鹵代醇脫鹵酶 （HheC）基因相似性為70%，表明該基因可能為一種鹵代醇脫鹵酶（HheC）基因。以提取的細(xì)菌DNA為模板，以T2-F，T2-R為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示，在約760 bp處有一條特異性的條帶 （泳道2），PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期相符，割膠回收產(chǎn)物連接至pUCm-T，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示獲得的Y基因片段含765 bp的核苷酸，包含以簡(jiǎn)便引物擴(kuò)增獲得的序列，該基因共編碼254個(gè)氨基酸。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸電泳分析Fig.1 Nucleic acid electrophoresis of PCR amplifications

2.2 基因Y編碼的氨基酸序列分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST軟件，以Y基因的氨基酸序列為模板進(jìn)行同源性序列比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖2。其氨基酸序列與已知的鹵代醇脫鹵酶A.tumefaciens HheC（PDB：1PWX_A）、A.tumefaciens HheB（AAD34609.1）和Arthrobacter sp.AD2 HheA（PDB：1ZMO_A）的相似性分別為 81%、75%和35%。另外，SyHheC還含有保守的鹵代醇脫鹵酶催化三聯(lián)體Ser132Thr145-Arg149，故推測(cè)SyHheC屬于鹵代醇脫鹵酶HheC類(lèi)。

圖2 不同鹵代醇脫鹵酶氨基酸的序列比對(duì)Fig.2 Amino acid sequence alignment of different halogenated alcohol dehalogenation enzymes

2.3鹵代醇脫鹵酶（SyHheC）重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，將克隆獲得的Y基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列SyhheC已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為 （KF853591.1），人工合成SyhheC與原Y基因序列對(duì)比見(jiàn)圖3。

圖3 人工合成SyhheC序列和篩選Y基因序列對(duì)比Fig.3 Compared with designed synthetic gene sequence SyhheC and the screening gene sequence Y

通過(guò)密碼子優(yōu)化后獲得重組質(zhì)粒pUCm-TSyhheC，經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ雙酶切，與同樣雙酶切的pET28a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E.coli BL21。經(jīng)T7通用引物PCR鑒定，可見(jiàn)約1 100 bp的條帶，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SyhheC成功轉(zhuǎn)入E.coli BL21。測(cè)序結(jié)果表明，pET28a-SyhheC中的SyhheC序列與預(yù)期相符，見(jiàn)圖4。

2.4 reSyHheC表達(dá)及純化

重組菌E.coli BL21/pET28a-SyhheC和陰性菌E.coli BL21/pET28a，經(jīng)1.0 mmol/L的IPTG于25℃誘導(dǎo)12 h后，SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖5。與對(duì)照E.coli BL21/pET28a相比 （圖5中泳道2），重組菌E.coli BL21/pET28a-SyhheC的表達(dá)產(chǎn)物在表觀相對(duì)分子質(zhì)量34 000處有明顯的蛋白質(zhì)條帶 （圖5中泳道3）。重組菌經(jīng)超聲破碎、離心獲得粗酶液，粗酶液經(jīng)鎳離子親和層析純化，SDS-PAGE結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)為單一條帶 （圖5中泳道1）。以底物2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇為底物，測(cè)得reSyHheC比活性為5 U/mg，而E.coli BL21/pET28a中并未檢測(cè)到鹵代醇脫鹵酶活性。結(jié)果表明，SyhheC基因在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。

圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定Fig.4 Identification of recombinant expression plasmid

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，關(guān)于鹵代醇脫鹵酶的研究報(bào)道逐年增多。傳統(tǒng)的通過(guò)基因或cDNA文庫(kù)開(kāi)發(fā)新基因的方法工作量較大，而且不易操作[12]。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，挖掘新基因的手段也越來(lái)越多[13]。利用生物信息學(xué)和基因組學(xué)相結(jié)合的方法從土壤中挖掘具有優(yōu)良性狀的新型酶是一條獲取優(yōu)良酶的有效途徑。

作者成功地利用宏基因組技術(shù)從土壤中篩選出一段編碼基因Y，其編碼的氨基酸序列與已知的來(lái)自根癌土壤桿菌 （A.tumefaciens）的鹵代醇脫鹵酶（HheC）的同源性為81%。并含有保守的鹵代醇脫鹵酶催化三聯(lián)體Ser132-Thr145-Arg149，推測(cè)其為一種新型鹵代醇脫鹵酶。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對(duì)Y基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化并人工合成，與pET28a質(zhì)粒連接后實(shí)現(xiàn)該基因在大腸桿菌E.coli BL21的高效表達(dá)。經(jīng)鎳離子親和層析獲得純化表達(dá)蛋白質(zhì)，通過(guò)SDS-PAGE鑒定出reSyHheC的相對(duì)分子質(zhì)量在約34 000。以2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇為底物，reSyHheC酶催化底物產(chǎn)生2-（4-硝基苯基）環(huán)氧乙烷，測(cè)定其比酶活為5 U/mg。本研究挖掘了一種新型的HheC基因，為鹵代醇脫鹵酶的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)，也為其它新酶基因的開(kāi)發(fā)提供了新的策略。

[1]DeJong R M，Tiesinga J J，Rozeboom H J，et al.Structure and mechanism of a bacterial haloalcohol dehalogenase：a new variation of the short-chain dehydrogenase/reductase fold without an NAD （P）H binding site[J].The EMBO Journal，2003，22（19）：4933-4944.

[2]鄭楷，湯麗霞.一種新型微生物鹵醇脫鹵酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2010，21（21）：121-125．

ZHENG Kai，TANG Lixia.Current research advances in bacterial halohydrin dehalogenases[J].Letters in Biotechnology，2010，21（21）：121-125.（in Chinese）

[3]王魁，汪思迪，黃睿，等.宏基因組學(xué)挖掘新型生物催化劑的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（4）：420-431.

WANG Kui，WANG Sidi，HUANG Rui，et al.Advances of metagenomics in discovering novel biocatalysts[J].Chin J Biotech，2012，28（4）：420-431.（in Chinese）

[4]Teeling H，Glockner F O.Current opportunities and challenges in microbial metagenome analysis-bioinformatic perspective[J]. Briefings in Bioinformatics，2012，13（6）：728-742.

[5]Kotik M，Stepanek V，Grulich M，et al.Access to enantiopure aromatic epoxides and diols using epoxide hydrolases derived from total biofilter DNA[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2010，65：41-48.

[6]聶洪麗，湯麗霞，張?jiān)姾＃?富集培養(yǎng)及高質(zhì)量DNA提取有利于從土壤宏基因組中獲取新鹵醇脫鹵酶基因[J].生物技術(shù)通訊，2010，21（6）：846-850.

NIE Hongli，TANG Lixia，ZHANG Shihai，et al.Enrichment cultivation and high quality DNA extraction represent an available strategy for isolation new halohydrin dehalogenase genes from soil metagenome[J].Letters in Biotechnology，2010，21（6）：846-850.（in Chinese）

[7]Knietsch A，Waschkowitz T，Bowien S，et al.Construction and screening of metagenomic libraries derived from enrichment cultures：generation of a gene bank for genes conferring alcohol oxidoreductase activity on Escherichia coli[J].Applied& Environmental Microbiology，2003，69（3）：1408-1416.

[8]張慧敏，李劍芳，鄔敏辰.圓弧青霉脂肪酶基因序列的生物信息學(xué)分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，4（29）：602-608.

ZHANG Huimin，LI Jianfang，WU Minchen.Bioinformatics Analysis on the sequence of lipase gene from Penicillium cyclopium [J].Journal of Food Science and Biotechnology，2010，29（4）：602-608.（in Chinese）

[9]金光澤，段作營(yíng)，張蓮芬，等.重組融合人血清白蛋白一人白介素一2 C125A突變體在畢赤酵母中的表達(dá)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29（4）：595-601.

JIN Guangze，DUAN Zuoying，ZHANG Lianfen，et al.Expression of the fusion protein human serum album mutanhuman interleukin 2 C125A in Pichia pastoris[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2010，29（4）：595-601.（in Chinese）

[10]李陽(yáng)，湯麗霞，鄭楷，等.重組鹵醇脫鹵酶的表達(dá)優(yōu)化及純化[J].化工學(xué)報(bào)，2010，61（12）：3212-3219.

LI Yang，TANG Lixia，ZHENG Kai，et al.Optimizing expression and halohydrin dehalogenase purification of recombinant from A.radiobacter AD1[J].CIESC Journal，2010，61（12）：3212-3219.（in Chinese）

[11]Jin H X，Hu Z C，Liu Z Q，et al.Nitrite-mediated synthesis of chiral epichlorohydrin using halohydrin dehalogenase from Agrobacterium radiobacter AD1[J].Biotechnology and Applied Biochemistry，2012，59：170-177.

[12]Wang J Q，Zhang H M，Wu M C，et al.Cloning and sequence analysis of a novel xylanase gene，Auxyn10A，from Aspergillus usamii[J].Biotechnology Letters，2011，33（5）：1029-1038.

[13]Shi H L，Yin X，Wu M C，et al.Cloning and bioinformatics analysis of an endoglucanase gene（Aucel12A）from Aspergillus usamii and its functional expression in Pichia pastoris[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2012，39（2）：347-357.

Gene Cloning,Sequence Analyais and Gene Expression of A New Halohydrin Dehalogenase

FENG Feng1， HU Die2， YU Tao1， ZENG Yan1， WU Minchen*3
（1.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Halohydrin dehalogenase catalyzes the synthesis ofoptically pure epoxides，β-substituted alcohol and other similar high-value chiral drug intermediates.Our laboratory screened an encoding gene Y from contaminated soil in Wuxi new district industrial park using metagenomic technology.The gene Y contains 765 bp nucleotides and encodes 254 amino acids. According to the Blast analysis，the amino acids sequence shares 81%homology with HheC from Agrobacterium tumefaciens and also has Ser132-Thr145-Arg149catalytic triad which is the same with the known Halohydrin dehalogenases.Thus，we speculated it belongs to HheC.According to Escherichiacoli BL21 codon preference，the optimized gene was synthesized and named as SyhheC.The constructed expression plasmid pET28a-SyhheC was transformed into E.coli BL21.The expressed enzyme with an apparent molecular weight of 34 000 by SDS-PAGE analysis was purified to homogeneity using Ni-NTA affinity chromatography and characterized using the substrate of 2-bromo-1-（4-nitrophenyl）ethanol.The activity of purified reSyHheC was 5.2 U/mg.This study provides a new strategy to excavate new enzymes with excellent characters from the soil.

halohydrin dehalogenase，metagenomic technology，sequence analysis，codon optimization，expression

Q 785

A

1673—1689（2015）05—0494—07

2014-02-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271811）。

*通信作者：鄔敏辰 （1962—），男，江蘇無(wú)錫人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶工程與基因工程研究。

E-mail：biowmc@126.com