機(jī)械活化釀酒酵母葡聚糖改善其水溶性

石紀(jì)奎， 李永富， 史 鋒*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

機(jī)械活化釀酒酵母葡聚糖改善其水溶性

石紀(jì)奎1， 李永富2， 史 鋒1*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

釀酒酵母葡聚糖是一種良好的免疫效應(yīng)應(yīng)答劑，但是不溶于水，這嚴(yán)重影響了它在食品、醫(yī)藥等行業(yè)中的應(yīng)用。對(duì)釀酒酵母葡聚糖進(jìn)行機(jī)械改性，顯著提高了它的溶解性。隨著機(jī)械強(qiáng)度和活化時(shí)間的增加，葡聚糖的溶解率從11%提高到37%?；罨蟮钠暇厶堑牧矫黠@變小，比表面積增大；微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)整性降低，表面呈現(xiàn)粗糙狀。紅外光譜分析證實(shí)，活化之后葡聚糖的主體化學(xué)結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變，但羥基吸收峰位置向低頻方向發(fā)生較大偏移，氫鍵鍵能降低，氫鍵相互作用減弱。這些變化有利于葡聚糖分子與水分子相互作用，提高酵母葡聚糖的溶解性。由此制備的水溶性葡聚糖具有良好的免疫活性，可以顯著刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6、NO，它們的分泌量分別是陰性對(duì)照組的29.3、28.3、5.6倍。因此機(jī)械活化是一種提高釀酒酵母葡聚糖溶解性的高效、簡(jiǎn)便、環(huán)保方法。

釀酒酵母葡聚糖；機(jī)械活化；水溶性

釀酒酵母是啤酒行業(yè)的主要微生物，每年因釀酒會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄釀酒酵母。釀酒酵母細(xì)胞壁含有豐富的多糖，其中40%-60%是β-D-葡聚糖[1]。研究表明，釀酒酵母葡聚糖是一種良好的生物效應(yīng)應(yīng)答劑，具有增強(qiáng)免疫力、激活免疫細(xì)胞、抗腫瘤、抗感染、抗氧化等功能[2]。但是釀酒酵母葡聚糖通過(guò)分子間氫鍵相互作用，形成致密的螺旋結(jié)構(gòu)，致使葡聚糖分子難以溶于水，這嚴(yán)重影響了釀酒酵母葡聚糖在食品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域上的應(yīng)用[3]。為了提高釀酒酵母葡聚糖的水溶性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了修飾和改性研究，主要方法包括化學(xué)方法和物理方法。化學(xué)修飾方法主要是通過(guò)在葡聚糖分子上引入親水性基團(tuán)而增加其水溶性，主要的修飾方法有硫酸化、羧甲基化、磷酸化修飾[4]。但是這類修飾通常在有機(jī)相體系以及強(qiáng)酸、強(qiáng)堿中進(jìn)行，不僅成本高、污染嚴(yán)重，而且葡聚糖的損失嚴(yán)重。物理方法主要是通過(guò)超聲波解聚，來(lái)降低葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量，從而增加其水溶性，但是超聲解聚只能降低葡聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量到一個(gè)極限恒定值，促進(jìn)葡聚糖溶解的效果不佳[5]。因此急需一種環(huán)保、簡(jiǎn)單、高效的方法促進(jìn)釀酒酵母葡聚糖的水溶性。

機(jī)械活化主要通過(guò)機(jī)械力的摩擦、剪切、沖擊等作用，使固體顆粒物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及物化性能發(fā)生改變，將部分機(jī)械能轉(zhuǎn)化為物質(zhì)內(nèi)能，從而增加固體顆粒物質(zhì)的化學(xué)活性。許多研究表明，機(jī)械活化可以顯著改變多糖的結(jié)晶結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量分布、分子鏈排列，從而提高多糖的化學(xué)反應(yīng)和酶解反應(yīng)活性[6-8]。通過(guò)機(jī)械活化對(duì)多糖進(jìn)行改性，具有簡(jiǎn)單、方便、無(wú)污染、成本低的優(yōu)點(diǎn)。作者利用一種行星球磨機(jī)活化釀酒酵母葡聚糖，以葡聚糖在水中的溶解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了機(jī)械力強(qiáng)度和作用時(shí)間對(duì)葡聚糖水溶性的影響。利用粒度分析儀、掃描電子顯微鏡和紅外光譜分析儀表征了機(jī)械活化前后釀酒酵母葡聚糖微觀形態(tài)和化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化，探討機(jī)械活化提高葡聚糖水溶性的原因。最后分析了水溶性的釀酒酵母葡聚糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和NO的刺激作用，了解其免疫性能。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

釀酒酵母葡聚糖：上海杰康諾生物技術(shù)有限公司；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7：浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；脂多糖（LPS）：美國(guó)Sigma公司；葡萄糖、蒽酮、溴化鉀、亞硝酸鈉、磺胺、N-（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。TNF-α、IL-6檢測(cè)試劑盒：美國(guó)eBioscience公司；DMEM完全培養(yǎng)基、0.25%胰酶：美國(guó)Gbico公司；胎牛血清（FBS）：浙江杭州四季青生物工程材料有限公司。

XXM行星球磨機(jī)：浙江嘉興中俄科技轉(zhuǎn)化中心；L-535R離心機(jī)：湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Freezone冷凍干燥機(jī)：美國(guó)LABCONCO公司；S3500激光粒度分析儀：美國(guó) Microtrac公司；NEXUS傅里葉紅外光譜分析儀：美國(guó)Nicolet公司；Quanta 200掃描電子顯微鏡：荷蘭FEI公司；Series 8000WJ二氧化碳培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo Scientific公司；ELX800酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母葡聚糖的機(jī)械活化處理將15 g釀酒酵母葡聚糖與150 g直徑為3 mm的磨球混勻后，一起放入行星球磨罐內(nèi)。調(diào)節(jié)電機(jī)轉(zhuǎn)速和運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間，得到不同的釀酒酵母葡聚糖處理樣品。用30目不銹鋼篩將磨球和葡聚糖分離，活化的葡聚糖密封保存，及時(shí)分析。

1.2.2溶解率的測(cè)定及水溶性釀酒酵母葡聚糖的制備取0.5 g活化的釀酒酵母葡聚糖樣品，加入20 mL去離子水，攪拌30 min促進(jìn)溶解，之后4 000 r/min離心20 min。收集上清液定容至25 mL，利用蒽酮法測(cè)定上清液中總糖的含量。

將上述釀酒酵母葡聚糖的上清液經(jīng)冷凍干燥得到固體水溶性釀酒酵母葡聚糖樣品。

1.2.3 粒度分布分析利用S3500激光粒度分析儀測(cè)定活化前后釀酒酵母葡聚糖的粒度分布。

1.2.4 紅外光譜分析將樣品與KBr按1∶50的比例混合研磨制成薄片，利用NEXUS傅里葉紅外光譜分析儀進(jìn)行掃描測(cè)試，范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.5 掃描電鏡分析利用Quanta 200掃描電子顯微鏡分析活化前后釀酒酵母葡聚糖的微觀形態(tài)。

1.2.6 水溶性釀酒酵母葡聚糖的免疫活性分析取小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，用DMEM完全培養(yǎng)液 （添加10%FBS，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，48 h之后用0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞計(jì)數(shù)備用。

調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)12 h，加入水溶性釀酒酵母葡聚糖，至終質(zhì)量濃度分別為50、100、500 μg/mL，以10、100、1 000 ng/mL LPS為陽(yáng)性對(duì)照，以培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h之后取上清液，利用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定其中的細(xì)胞因子TNF-α、IL-6含量；繼續(xù)培養(yǎng)48 h之后取上清液，按照文獻(xiàn)[9]測(cè)定NO含量。使用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同時(shí)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異性，*P＜0.05表示顯著差異，**P＜0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母葡聚糖的溶解率

通過(guò)調(diào)節(jié)行星球磨機(jī)的電機(jī)轉(zhuǎn)速，改變機(jī)械力的輸出強(qiáng)度，考察了球磨機(jī)轉(zhuǎn)速和作用時(shí)間對(duì)活化的釀酒酵母葡聚糖在水中溶解率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

當(dāng)行星球磨機(jī)的轉(zhuǎn)速在837 r/min時(shí)，隨著球磨時(shí)間由0 min增加到20 min，葡聚糖的溶解率從11%逐漸增加到30%。同時(shí)當(dāng)轉(zhuǎn)速調(diào)整為1 116 r/min時(shí)，葡聚糖的溶解率從11%增加到37%?？紤]到實(shí)驗(yàn)操作的安全性以及樣品的損失率，最終將轉(zhuǎn)速確定為1 116 r/min，時(shí)間定為20 min，以此對(duì)釀酒酵母葡聚糖進(jìn)行機(jī)械活化，以制備水溶性的葡聚糖。由此可知，在強(qiáng)烈的摩擦、剪切、擠壓、沖擊等機(jī)械力的作用下，釀酒酵母葡聚糖的溶解率顯著增加。為了了解機(jī)械活化提高釀酒酵母葡聚糖水溶性的原因，對(duì)活化前后的葡聚糖進(jìn)行粒度分布分析、微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)分析和化學(xué)結(jié)構(gòu)分析。

圖1 不同活化條件下釀酒酵母葡聚糖的溶解率Fig.1 Water-solubility of Saccharomyces cerevisiae β-D-glucan after mechanical activation

2.2 釀酒酵母葡聚糖的粒度分布

釀酒酵母葡聚糖機(jī)械活化前后的粒度分布見(jiàn)圖2。未經(jīng)過(guò)活化的釀酒酵母葡聚糖顆粒粒度集中在40～100 μm，并且分布狹窄（圖2a）。經(jīng)過(guò)1 116 r/min機(jī)械活化20 min之后，釀酒酵母葡聚糖的粒度明顯變小，集中在0.5～10 μm（圖2b）。這說(shuō)明釀酒酵母葡聚糖顆粒在機(jī)械活化過(guò)程中，受到了剪切力、擠壓力、摩擦力、沖擊力等機(jī)械力的作用，強(qiáng)烈的機(jī)械力作用破壞了葡聚糖分子的致密結(jié)構(gòu)，致使葡聚糖顆粒的粒度變小。而葡聚糖顆粒粒度的降低和比表面積增加，有利于水分子與葡聚糖分子相互作用，增加活化之后葡聚糖的水溶性。

圖2 機(jī)械活化前后釀酒酵母葡聚糖粒度分布Fig.2 Particle size distribution of Saccharomyces cerevisiae β -D-glucan before and after mechanical activation

2.3 釀酒酵母葡聚糖的微觀形態(tài)

采用掃描電子顯微鏡分析活化前后釀酒酵母葡聚糖的微觀形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖3。表明經(jīng)過(guò)機(jī)械活化之后的釀酒酵母葡聚糖顆粒微觀形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。未經(jīng)活化的釀酒酵母葡聚糖顆粒呈現(xiàn)出干癟的小球狀，顆粒的表面比較光滑，經(jīng)過(guò)機(jī)械活化之后的酵母葡聚糖顆粒顯著變小，顆粒變得雜亂無(wú)章，表面變得粗糙，呈現(xiàn)無(wú)規(guī)則狀。說(shuō)明機(jī)械活化可以破壞酵母葡聚糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)，增大比表面積，從而有利于水分子與酵母葡聚糖相互作用，增強(qiáng)釀酒酵母葡聚糖的水溶性。

圖3 機(jī)械活化前后釀酒酵母葡聚糖的掃描電鏡圖Fig.3 SEM of Saccharomyces cerevisiae β-D-glucan before and after mechanical activation

2.4 釀酒酵母葡聚糖紅外光譜

紅外光譜分析方法是多糖研究中檢測(cè)化學(xué)結(jié)構(gòu)常用的方法。圖4是活化前后釀酒酵母葡聚糖的紅外光譜圖。3 430 cm-1是多糖的-OH吸收峰，2 923 cm-1和1 422 cm-1是多糖中C—H鍵的吸收峰。比較活化前后葡聚糖紅外圖譜，沒(méi)有出現(xiàn)新的紅外吸收峰，說(shuō)明活化過(guò)程中釀酒酵母葡聚糖始終保持原有的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。但羥基吸收峰的位置向低波長(zhǎng)移動(dòng)，根據(jù)公式ΔE=hc（v1-v2）（其中ΔE為氫鍵能量變化，h為普朗克常數(shù)，c為光速，v1、v2分別為機(jī)械活化前后羥基的伸縮振動(dòng)峰波數(shù)）可計(jì)算出與羥基相關(guān)的氫鍵平均鍵能變化[10]。在1 116 r/min活化20 min后，釀酒酵母葡聚糖羥基氫鍵能量降低了5.52×10-3eV，表明經(jīng)過(guò)機(jī)械活化處理降低了氫鍵鍵能，減弱葡聚糖分子氫鍵的相互作用，有利于水分子進(jìn)入到葡聚糖顆粒內(nèi)部，從而提高葡聚糖的水溶性。

圖4 機(jī)械活化前后釀酒酵母葡聚糖的紅外光譜圖Fig.4 FTIR of Saccharomyces cerevisiae β-D-glucan before and after mechanical activation

2.5 水溶性釀酒酵母葡聚糖的免疫活性

巨噬細(xì)胞在人的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。巨噬細(xì)胞可以分泌TNF-α、IL-6、NO等來(lái)介導(dǎo)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。因此作者利用巨噬細(xì)胞RAW 264.7探討機(jī)械活化后形成的水溶性釀酒酵母葡聚糖（SG）對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6、NO量的變化。水溶性釀酒酵母葡聚糖是將釀酒酵母葡聚糖經(jīng)過(guò)1 116 r/min機(jī)械活化20 min之后，離心取上清液，最后經(jīng)冷凍干燥制備而得。

2.5.1 水溶性葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞分泌NO的刺激作用圖5顯示了在水溶性葡聚糖刺激24 h之后，巨噬細(xì)胞RAW 264.7產(chǎn)生的NO含量。隨著葡聚糖質(zhì)量濃度的提高，NO含量隨之增加，呈現(xiàn)濃度依懶性。當(dāng)G40-20質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，產(chǎn)生的NO濃度達(dá)到36.5 μmol/mL，而陰性對(duì)照組僅為6.5 μmol/mL。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比表現(xiàn)出極顯著的差異，說(shuō)明水溶性葡聚糖可以極顯著的刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO。

圖5 巨噬細(xì)胞分泌的NO濃度Fig.5 Amount of NO secreted by macrophage

2.5.2 水溶性葡聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6的刺激作用利用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定了經(jīng)水溶性葡聚糖刺激后巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子含量，結(jié)果見(jiàn)圖6-7。經(jīng)水溶性葡聚糖刺激24 h之后，巨噬細(xì)胞RAW 264.7分泌細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的質(zhì)量濃度極顯著提高。水溶性葡聚糖在低質(zhì)量濃度下已經(jīng)呈現(xiàn)出良好的刺激作用，質(zhì)量濃度越高刺激作用越明顯。當(dāng)SG質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6的量分別達(dá)到142.22 ng/mL和1.70 ng/mL，而陰性對(duì)照組僅為4.85 ng/mL和0.06 ng/mL。這說(shuō)明水溶性的葡聚糖可以極顯著性的刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6。

3 結(jié)語(yǔ)

釀酒酵母葡聚糖是釀酒酵母細(xì)胞壁重要的組成成分，具有良好的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)作用，但由于其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)而不溶于水。作者在固相狀態(tài)下利用一種行星球磨機(jī)活化釀酒酵母葡聚糖，以提高其溶解性。經(jīng)過(guò)機(jī)械活化之后釀酒酵母葡聚糖在水中的溶解率明顯提高，最高達(dá)到37%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，活化的釀酒酵母葡聚糖顆粒粒度顯著降低；利用掃描電鏡觀察顆粒的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母葡聚糖顆粒在機(jī)械力的作用下，微觀形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，顆粒細(xì)化，表面粗糙不規(guī)整。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)活化的酵母葡聚糖的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生變化，但是氫鍵鍵能降低，葡聚糖氫鍵相互作用減弱。表明經(jīng)過(guò)機(jī)械活化之后，釀酒酵母葡聚糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，致密的螺旋結(jié)構(gòu)受到一定的破壞，這些結(jié)構(gòu)的變化有助于葡聚糖分子與水分子進(jìn)一步相互作用，增加釀酒酵母葡聚糖的溶解性。通過(guò)檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7受水溶性葡聚糖刺激之后產(chǎn)生TNF-α、IL-6以及NO的質(zhì)量濃度變化，表明水溶性釀酒酵母葡聚糖可以極顯著地刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-6以及NO，這說(shuō)明通過(guò)機(jī)械活化制備的水溶性葡聚糖具有良好的免疫活性。因此機(jī)械活化是一種簡(jiǎn)單、高效、綠色環(huán)保的釀酒酵母葡聚糖的改性方法。

圖6 巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的質(zhì)量濃度Fig.6 Amount of TNF-α secreted by macrophage

圖7 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的質(zhì)量濃度Fig.7 Amount of IL-6 secreted by macrophage

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Improve Water-Solubility of β-D-Glucan from Saccharomyces cerevisiae by Mechanical Activation

SHI Jikui1， LI Yongfu2， SHI Feng1*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermention Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The β-D-glucan from Saccharomyces cerevisiae is a potent biological response modifier. But it is insoluble in water.This is the major obstacle for its application in the food and medical fields.In order to improve the water-solubility of β-D-glucan from S.cerevisiae，mechanical activation was performed here in the solid state by using a planetary ball miller.The water-solubility of β-D-glucan increased sharply from 11%to 37%，as the mechanical force and activation time increased.After mechanical activation，the particle size of β-D-glucan decreased obviously and its morphological structure became to be irregular and rough.The basic chemical structure of β-D-glucan was not destroyed based on FTIR analysis，but the energy of hydrogen bond decreased.These changes would be benefit for β-D-glucan to interact with water molecule and therefore to increase its solubility.Most importantly，the soluble β-D-glucan prepared by this method could significantly stimulate the macrophage cells to secrete TNF-α，IL-6 and NO.Their concentrations were 29.3-，28.3-and 5.6-folds that of the controls，respectively.These results indicate that mechanical activation is a simple，environmentally friendly and efficient method to improve water-solubility of β-D-glucan.

β-D-glucan from Saccharomyces cerevisiae，mechanical activation，water-solubility

TS 261.9

A

1673—1689（2015）05—0536—06

2014-02-11

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（BE2012428）。

*通信作者：史 峰（1970—），女，新疆烏魯木齊人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事微生物代謝工程方面的研究。

E-mail：shifeng@jiangnan.edu.cn