新疆阿魏菇抗氧化肽分離純化及抗氧化性質(zhì)

鄭曉吉， 許程劍， 牛博楠， 陳 帥， 王雪銘， 朱麗莉

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832003）

新疆阿魏菇抗氧化肽分離純化及抗氧化性質(zhì)

鄭曉吉， 許程劍*， 牛博楠， 陳 帥， 王雪銘， 朱麗莉

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832003）

采用超濾法、離子交換層析和凝膠過濾層析分離阿魏菇抗氧化多肽，研究其抗氧化性能。以胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合酶解阿魏菇多肽水解物為原料，采用超濾法分離阿魏菇水解液，使用10 000的超濾膜，將阿魏菇水解液分離成10 000以下的多肽組分和大于10 000的多肽組分，小于10 000的多肽組分的·OH自由基清除能力和DPPH·自由基清除能力較高。小于10 000的多肽組分經(jīng)DEAE-32纖維素分離，得到3個洗脫峰，其中P3組分的羥基清除能力較高，達(dá)到

阿魏菇；抗氧化肽；分離純化；抗氧化

Keywords：Pleurotus ferulae lenzi，antioxidant peptides，separation and purification，anti-oxidation

阿魏菇（Pleurotus ferulae lenzi）是新疆特色的食用菌，因其腐生或寄生在阿魏肥大的根莖部而得名，是一種干旱草原上生長的藥食兩用的食用菌，被譽為“西天白靈芝”、“草原上的牛肝菌”等美名。主要分布在印度、法國、中國新疆等地。在新疆分布在新疆準(zhǔn)葛爾盆地邊緣，這些區(qū)域一般都靠近沙漠，如伊犁、塔城、阿爾泰和木壘地區(qū)。阿魏菇子實體潔白如玉，肉質(zhì)細(xì)嫩，營養(yǎng)豐富全面，其中富含蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、維生素、不飽和脂肪酸、鈣、磷、鋅、錳、硒等營養(yǎng)成分，且蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占干菇的20%，含有18種氨基酸，具備人體必需的8種氨基酸[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，阿魏菇在抗誘變、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞等方面具有良好的開發(fā)利用前景[2-4]。

阿魏菇抗氧化肽作為一種生物活性肽，既可以為機(jī)體提供營養(yǎng)，又可以清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基，具有增強(qiáng)機(jī)體抵御疾病、延緩衰老的作用。從阿魏菇中提取抗氧化肽不但經(jīng)濟(jì)效益好，并且天然健康。由于阿魏菇中蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)的多樣性，水解后的蛋白質(zhì)也具有多樣性，包含未完全水解的蛋白質(zhì)、蛋白酶、多肽、寡肽、氨基酸和其他雜質(zhì)。為了能得到純度相對較高的多肽成分，還需對阿魏菇蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。分離多肽常用的方法有：超濾法、層析法、高效液相色譜法、凝膠色譜法等多種方法，其中大部分方法都是用活性肽的理化指標(biāo)作為分離純化的目的。分離多肽可以單獨使用一種方法，如林倩[5]利用超濾法分離竹筍多肽，分別選用截留相對分子質(zhì)量為5 000和1 000的竹筍多肽，優(yōu)化了一級超濾和二級超濾，最終確定了超濾的最優(yōu)條件。幾種分離方法綜合使用可以使分離效果更佳，如Bin Wang[6]等選用超濾、離子交換層析法、凝膠過濾層析分離法和反相高效液相色譜法對醇溶雙髻鯊多肽進(jìn)行分離純化，最終獲得抗氧化活性較高的抗氧化多肽活性組分。

作者采用超濾法、離子交換層析和凝膠過濾層析綜合分離阿魏菇抗氧化多肽，以清除羥自由基的能力作為評價指標(biāo)。超濾法采用截留相對分子質(zhì)量為10 000的超濾膜，將阿魏菇多肽分成兩個組分后，選擇抗氧化活性高的組分進(jìn)行離子交換層析，之后采用葡聚糖凝膠SephadexG-25進(jìn)一步將阿魏菇抗氧化肽分離純化，并初步測定其相對分子質(zhì)量分布。并對阿魏菇抗氧化肽清除2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH·）、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）還原能力進(jìn)行測定，同時與維生素C作對照，測定其抗氧化活性，旨在為新疆阿魏菇有效成分的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏菇：新疆清河出產(chǎn)；胃蛋白酶：Biotopped公司；胰蛋白酶：Sigma公司；DEAE-32纖維素：Pharmacia公司；SephadexG-25：Sigma公司；10 000超濾膜（Pall Corporation）；牛血清白蛋白；維生素B12；氧化型谷胱甘肽；還原性谷胱甘肽；L-酪氨酸；Tris；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

阿魏菇抗氧化肽：制備；抗壞血酸、DPPH、無水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、鄰苯三酚、Tris、鐵氰化鉀、三氯化鐵：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV759紫外可見分光光度器：上海精科；BS2000電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；LG100B鼓風(fēng)干燥箱：上海實驗儀器廠；Neofuge15R臺式高速冷凍離心機(jī)：香港力康；真空冷凍干燥，上海愛朗儀器有限公司；酸度計：德國賽多利斯股份公司；超濾裝置：科爾-帕默儀器公司；全自動收集器：上海琪特分析儀器有限公司；ELx808酶標(biāo)儀，Biotek。

1.3 試驗方法

1.3.1 超濾法分離純化阿魏菇抗氧化肽阿魏菇抗氧化多肽配成20 mg/mL的溶液待用。組裝超濾裝置，將截留量為10 000的超濾膜裝入裝置，蒸餾水沖洗濾膜30 min。在室溫條件下，壓力30 000 Pa，將阿魏菇多肽水解液經(jīng)循環(huán)泵輸入到膜組件中。經(jīng)過超濾裝置可以將阿魏菇多肽水解液分為兩個組分。超濾完成后用0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液正反沖洗濾膜30 min。最后，將分離到的兩組分分別透析36 h后冷凍干燥，并測定其清除·OH自由基的能力[7-9]。

1.3.2 DEAE-32纖維素離子交換層析分離純化阿魏菇多肽[10]

1）DEAE-32纖維素的活化處理：稱取DEAE-32干粉10 g，浸泡在蒸餾水中大約24 h，然后傾去上層雜質(zhì)，抽干。用0.5 mol/L的HCl溶液浸泡2 h，用去離子水沖洗到顯中性為止，抽干。用0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡2 h，用去離子水沖洗到顯中性為止，抽干即可使用。

2）裝柱、平衡、上樣、洗脫、收集：DEAE-32洗脫。用50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）的緩沖液平衡柱床，上樣量2 mL，用0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl平衡緩沖液分段洗脫，上樣流速為1.5 mL/min，洗脫流速為1.0 mL/min，紫外檢測波長220 nm。

1.3.3 葡聚糖凝膠SephadexG-25分離純化阿魏菇多肽

1）葡聚糖凝膠SephadexG-25的活化處理：稱取SephadexG-25干粉10 g[11]，浸泡在蒸餾水中大約24 h，然后傾去上層雜質(zhì)，抽干。用1 mol/L的NaOH溶液浸泡1 h，然后洗滌至中性。

2）裝柱、平衡、上樣、洗脫、收集：與離子交換層析相同。

3）葡聚糖凝膠SephadexG-25的洗脫條件：平衡緩沖溶液為100 mmol/L、pH7.5的Tris-HCl，收集過DEAE-32后抗氧化活性高的組分為上樣液，上樣量為2 mL，上樣流速為0.3 mL/min，洗脫流速為0.2 mL/min，每管收集5 min，紫外檢測波長220 nm。

1.4 阿魏菇抗氧化肽的相對分子質(zhì)量分布

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在文獻(xiàn)[12-13]的基礎(chǔ)上，將方法略加改動。將相對分子質(zhì)量已知的標(biāo)品BSA（6 700）、維生素B12（1 355）、氧化型谷胱甘肽（612）、還原性谷胱甘肽（307）、L-酪氨酸（181），用蒸餾水將其配制成25 mg/mL的溶液，用濾膜過濾，然后分別進(jìn)樣2 mL。洗脫程序按照1.3.3，然后分別記下凝膠柱床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）和分離物本身的體積（Ve），計算有效分配系數(shù)Kav

Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）

用相對分子質(zhì)量的常用對數(shù)lgMw為縱坐標(biāo)，Kav為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 阿魏菇多肽的相對分子質(zhì)量的測定將SephadexG-25分離得到的抗氧化活性最高的成分配成25 mg/mL的多肽溶液，膜過濾后按照1.3.3的洗脫程序洗脫。

1.5 抗氧化性能試驗

1.5.1 DPPH·自由基清除能力的測定參照Qiang Zhao[14]等的方法并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，具體方法如下：先向試管中加入3 mL DPPH·（0.1 mmol/L）乙醇溶液，再添加2 mL樣品溶液，將混合物振蕩后在室溫下避光靜置 30 min，517 nm下測定其吸光值。

DPPH·清除率=1-（A1-A2）/A3

式中：A1為DPPH+樣品測定值；A2為95%乙醇+樣品測定值；A3為DPPH+蒸餾水測定值。

1.5.2 ·OH自由基清除能力的測定參照林倩[5]的方法，具體方法如下：在試管中依次加入 3.5 mL去離子水，0.5 mL水楊酸（9.1 mmol/L）-乙醇溶液，0.5 mL樣品，0.5 mL FeCl2溶液 （9.1 mmol/L），5 mL H2O2（8.8 mmol/L），振蕩混勻，即可測定其在510 nm下吸光度A1。

羥自由基清除率=1-（A1-A2）/A3

式中：A1為樣品測定值；A2為取0.5 mL的蒸餾水代替9 mmoL/L的FeCl2；A3為取0.5 mL去離子水替代樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 超濾法分離純化阿魏菇多肽的結(jié)果

利用10 000的超濾膜將阿魏菇多肽分成兩個組分，然后分別測定這兩個組分的抗氧化活性，結(jié)果見表1。

表1 超濾分離結(jié)果Table 1 Results of ultrafiltration

由表1可知，10 000的超濾膜可以將阿魏菇多肽分離成大于10 000的多肽組分和小于10 000的多肽組分，測定這兩個組分的·OH清除能力和清除DPPH·能力，由測定結(jié)果可知，小于10 000的多肽組分的抗氧化活性較高，可以用于下一步的分離純化。

2.2 DEAE-32分離阿魏菇多肽的結(jié)果

相對分子質(zhì)量為1 000～10 000的阿魏菇多肽經(jīng)DEAE-32分離后在220 nm處檢測，得到3個洗脫峰，分別命名組分P1、P2、P3。然后分別收集這3個組分，冷凍干燥后分別配制成25 mg/mL的多肽溶液，分別測定其清除·OH的能力。由圖1可知，相對分子質(zhì)量為 1 000～10 000的阿魏菇多肽經(jīng)DEAE-32分離后，在220 nm處檢測，得到3個洗脫峰，分別命名組分P1、P2、P3。然后分別收集這3個組分，冷凍干燥后分別配制成25 mg/mL的多肽溶液，分別測定其清除·OH的能力。

圖1 DEAE-32純化阿魏菇多肽的層析圖Fig.1 Elution profile of Pleurotus ferulae lenzi peptide on DEAE-32 column

由圖2可知，由DEAE-32分離得到的三個組分的·OH自由基清除能力大小關(guān)系為P3＞P1＞P2，P3的清除·OH的能力達(dá)到50.22%，由此選取組分P3做進(jìn)一步分離純化的研究。

圖2 各組分清除·OH自由基的能力Fig.2 ·OH radical seavenging activity of Pleurotus ferulae lenzi polypeptide

2.3 葡聚糖凝膠SephadexG-25分離純化阿魏菇多肽水解液結(jié)果

圖3為葡聚糖凝膠SephadexG-25分離DEAE-32洗脫出的組分P3的結(jié)果，經(jīng)過葡聚糖凝膠SephadexG-25分離后，在220nm處檢測洗脫峰，共得到5個峰，分別命名為組分P3-1、組分P3-2、組分P3-3、組分P3-4、組分P3-5。然后分別多次收集這5個組分，冷凍干燥后配制成25 mg/mL的多肽溶液，分別測定其·OH自由基的清除能力，見圖4。

圖3 SephadexG-25純化阿魏菇多肽的層析圖Fig.3 Elution profile of Pleurotus ferulae lenzi peptide on sephadexG-25 column

圖4 各組分清除·OH自由基的能力Fig.4 ·OH radical seavenging activity of Pleurotus ferulae lenzi polypeptide

由葡聚糖凝膠SephadexG-25分離純化出的各組分的·OH自由基清除能力的大小為P3-2＞P3-5＞P3-1＞P3-3＞P3-4，并且組分P3-2的·OH自由基清除能力達(dá)到77.23%，具有較高的抗氧化活性，可用于下一步的分析研究。

2.4 阿魏菇多肽相對分子質(zhì)量的分布

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制SephadexG-25分離范圍為1 000～5 000，標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量對數(shù)與有效分配系數(shù)的關(guān)系為Y＝-7.205 2X+4.440 1（X為有效分配系數(shù)，Y為相對分子質(zhì)量對數(shù)），R2=0.988 4，見圖5。

2.4.2 阿魏菇多肽分子量的分布將SephadexG-25分離得到的P3-2組分收集后再次由SephadexG-25進(jìn)行分離鑒定，見圖6。組分P3-2經(jīng)葡聚糖凝膠SephadexG-25分離后為單一組分，同時計算分離物本身的體積為10.6 mL，計算得出有效分配系數(shù)Kav為0.162 5，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方程得相對分子質(zhì)量大約為1 862。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品各指標(biāo)的測定值Table 2 Measured value of standard dextrans

圖5 相對分子質(zhì)量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Calibration curve of determining molecular weight

圖6 組分P3-2的葡聚糖凝膠SephadexG-25的洗脫圖譜Fig.6 Sephadex G-25 elution pattem of P3-2

3 結(jié)語

1）作者以胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合酶解阿魏菇多肽的水解物為原料，首先利用超濾法分離阿魏菇水解液，使用10 000的超濾膜，將阿魏菇水解液分離成大于10 000的多肽組分和小于10 000的多肽組分，并且小于10 000的多肽組分的清除·OH能力和清除DPPH能力均高于大于10 000的多肽組分。

2）將小于10 000的多肽組分經(jīng)DEAE-32纖維素分離后，在220 nm處檢測洗脫峰，得到3個洗脫峰，并且組分P3的羥基清除能力較高，達(dá)50.22%。

3）將DEAE-32纖維素分離得到的P3組分由葡聚糖凝膠SephadexG-25分離，在220 nm處得到5個洗脫峰，組分P3-2的清除·OH的能力最高，達(dá)到77.23%。

4）利用葡聚糖凝膠SephadexG-25測定分離純化后的多肽分子，其結(jié)果為出現(xiàn)單一組分，其相對分子質(zhì)量大約為1 862。

5）對分離純化的阿魏菇多肽進(jìn)行抗氧化活性研究，分別測定了阿魏菇多肽的DPPH·自由基清除能力、·OH自由基的清除能力、O2-·自由基的清除能力和還原力。結(jié)果表明，阿魏菇多肽的抗氧化活性較高，具有進(jìn)一步研究的價值。

本研究對于抗氧化肽的分離純化只局限在初級階段，對深層次的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、活性機(jī)理探究有待進(jìn)一步研究。如何進(jìn)一步對阿魏菇抗氧化肽對機(jī)體生物大分子的保護(hù)作用機(jī)理開展研究，將為阿魏菇的功能性利用提供更加詳盡的理論依據(jù)。

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Separation,Purification and Antioxidant Activity Study of Antioxidant Peptides from Pleurotus ferulae lenzi in Xinjiang

ZHENG Xiaoji， XU Chengjian*， NIU Bonan， CHEN Shuai， WANG Xueming， ZHU Lili
（School of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

Antioxidant peptides of Pleurotus ferulae lenzi were separated using ultra-filtration，ion-exchange and gel filtration chromatography，and its antioxidant properties were also studied in this study.Two kinds of peptides（＞10 000 polypeptide components and＜10 000 polypeptide components）were isolated from the hydrolyzed solution of Pleurotus ferulae lenzi protein.The polypeptide components under 10 000 have higher·OH radical scavenging and DPPH·radical scavengingcapacitythan those above 10 000.After detachingofpolypeptide componentsunder 10 000 by DEAE-32，three elution peaks were obtained and P3 component showed higher hydroxyl scavenging capacity，reaching 50.22%.Five elution peaks at 220 nm were further isolated from P3 component by Sephadex G-25，and P3-2 component showed best capacity of·OH radical scavenging，reaching 77.23%.According to standard equation，the molecular weight of P3-2 was about 1 862.The results provide a theoretical basis for further studies of active ingredient from Pleurotus ferulae lenzi in Xinjiang province.

TQ 936.1

A

1673—1689（2015）05—0524—06

2014-02-04

國家自然科學(xué)基金項目（31101256）。

鄭曉吉（1982—），男，甘肅通渭人，農(nóng)學(xué)碩士，講師，主要從事新疆特色資源綜合利用方面的研究。E-mail：zhengxj1982@163.com

*通信作者：許程劍（1978—），男，新疆石河子人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物制備與功能活性方面的研究。

E-mail：37377869@qq.com

50.22 %。P3組分采用葡聚糖凝膠SephadexG-25分離，在220 nm處得到5個洗脫峰，組分P3-2的羥自由基清除最高，達(dá)到77.23%，具有較高的抗氧化活性，其相對分子質(zhì)量大約為1 862。