99Tcm-MNLS 與99Tcm-HL91乏氧顯像評(píng)估腫瘤放療后乏氧狀態(tài)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究

胡玉敬，邊艷珠，張文艷，吳大勇，魏 強(qiáng)

(河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,石家莊 050051)

論著·基礎(chǔ)研究

99Tcm-MNLS 與99Tcm-HL91乏氧顯像評(píng)估腫瘤放療后乏氧狀態(tài)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究

胡玉敬，邊艷珠△，張文艷，吳大勇，魏 強(qiáng)

(河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,石家莊 050051)

目的99Tcm-MNLS、99Tcm-HL91放射性核素乏氧顯像監(jiān)測(cè)腫瘤放療后乏氧狀態(tài)變化的對(duì)比研究。方法建立24只荷瘤小鼠模型，待腫瘤直徑約1 cm時(shí)，按隨機(jī)數(shù)字表法等分為99Tcm-HL91即刻顯像組、99Tcm-HL91 48 h顯像組、99Tcm-MNLS即刻顯像組、99Tcm-MNLS 48 h顯像組。荷瘤小鼠腫瘤部位均給予單次25 Gy的放射治療，分別于放療后即刻、48 h注射相應(yīng)乏氧顯像劑99Tcm-MNLS或99Tcm-HL91，2 h后顯像，應(yīng)用感興趣區(qū)技術(shù)(ROI)計(jì)算腫瘤/非腫瘤組織放射性比值(T/NT)，腫瘤標(biāo)本行乏氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)免疫組織化學(xué)染色。對(duì)所得T/NT比值及HIF-1α免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果99Tcm-MNLS即刻顯像組T/NT比值、HIF-1α表達(dá)量(3.36±0.20、88.55%±0.83%)均較其48 h顯像組(2.25±0.43、22.75%±3.35%)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。99Tcm-HL91組即刻顯像組T/NT比值、HIF-1α表達(dá)量(3.23±0.90、90.55%±2.61%)均較其48 h顯像組(2.79±0.85、25.88%±3.76%)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。99Tcm-MNLS和99Tcm-HL91組即刻顯像組T/NT、HIF-1α表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，48 h顯像組T/NT差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。99Tcm-MNLS顯像在腹部除腎臟外無(wú)明顯濃集，而99Tcm-HL91全腹均有濃集。結(jié)論99Tcm-MNLS與99Tcm-HL91乏氧顯像監(jiān)測(cè)腫瘤放療后乏氧狀態(tài)的變化效能相近，均能準(zhǔn)確地反映腫瘤內(nèi)的乏氧狀態(tài)。

甲硝唑；锝；缺氧；肝腫瘤；小鼠；放射性核素顯像；乏氧誘導(dǎo)因子-1α

乏氧(hypoxia)是腫瘤難以治愈、容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因之一[1-2]，利用影像學(xué)手段檢測(cè)腫瘤組織的乏氧范圍、程度等為腫瘤的診斷和治療提供重要依據(jù)[3]，其中放射性核素乏氧顯像檢測(cè)腫瘤的方法備受關(guān)注。99Tcm-HL91(4,9-二氮-3,3,10,10-四甲基十二烷-2,11-二酮肟，亦稱 BnAO)是SPECT非硝基咪唑類乏氧顯像劑,對(duì)鼻咽癌、肺癌等診斷有較高的陽(yáng)性率，并且能夠預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)肺癌等放療療效[4]。但腫瘤對(duì)99Tcm-HL91的絕對(duì)攝取值偏低，且腹部聚集大量放射性物質(zhì)不利于對(duì)腹部腫瘤的顯像[5]。99Tcm標(biāo)記的硝基咪唑類乏氧顯像劑99Tcm-MNLS[2-(2-甲基-5-硝基-1H-咪唑-1-基)磷酸乙酯,即甲硝唑磷酸酯]是新合成的乏氧顯像劑，初步研究表明99Tcm-MNLS在血液中清除快，腫瘤顯像早，主要通過(guò)腎臟排泄[6]。本實(shí)驗(yàn)建立了荷H22型肝癌細(xì)胞的昆明小鼠模型，進(jìn)行乏氧顯像探討在放射性核素腫瘤乏氧顯像方面99Tcm-MNLS是否優(yōu)于99Tcm-HL91，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠24只，雌雄不限，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)小鼠均自由飲水，12/12 h明暗交替，實(shí)驗(yàn)室溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度40%～60%，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境符合GB14925-2001普通環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與試劑 Millennium VG Hawkeye型單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)儀為美國(guó)GE公司產(chǎn)品，Elekta Synergy直線加速器為英國(guó)Elekta Limited公司產(chǎn)品，鉬锝發(fā)生器由北京原子高科提供。MNLS、HL91凍干品購(gòu)于中國(guó)北京欣科思達(dá)醫(yī)藥科技有限公司，10%鹽酸溶液購(gòu)于石家莊市華迪化工工貿(mào)有限公司，甲醇購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑公司，乏氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 建立動(dòng)物模型 于小鼠右前肢腋窩皮下接種0.1 mL H22肝癌細(xì)胞株，細(xì)胞濃度約為2×108個(gè)/mL，清潔環(huán)境下飼養(yǎng)8 d，待腫瘤最大徑約1 cm，選取形態(tài)規(guī)整、大小無(wú)顯著性差異的荷瘤小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 標(biāo)記乏氧顯像劑 分別取MNLS、HL91凍干品1支，將新鮮淋洗的99Tcm液用生理鹽水調(diào)整至7.4 MBq/0.1 mL后，注入凍干品中，手工震蕩搖勻，室溫靜置10 min后分別應(yīng)用聚酰胺片/10%鹽酸溶液體系和新華1號(hào)/甲醇溶液體系測(cè)定99Tcm-MNLS和99Tcm-HL91的放射化學(xué)純度。

1.2.3 荷瘤小鼠腫瘤放療后99Tcm-MNLS、99Tcm-HL91乏氧顯像 造模成功的24只荷瘤小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法等分為4組：99Tcm-MNLS即刻顯像組、99Tcm-MNLS 48 h顯像組、99Tcm-HL91即刻顯像組、99Tcm-HL91 48 h顯像組，每組6只。各組荷瘤小鼠腫瘤部位均給予直線加速器6 MV的電子線單次照射25 Gy，放療后即刻和48 h分別經(jīng)尾靜脈注入相應(yīng)乏氧顯像劑后2 h顯像。圖像采集參數(shù)：SPECT配備低能高分辨準(zhǔn)直器，每幀圖像采集200 K，矩陣為256×256，放大4倍。在各組所得圖像上應(yīng)用感興趣區(qū)技術(shù)(ROI)，計(jì)算腫瘤部位與對(duì)側(cè)部位的放射性計(jì)數(shù)(T/NT)比值。

1.2.4 HIF-1α免疫組織化學(xué)染色 各組荷瘤小鼠顯像結(jié)束后立即脫頸處死，剝?nèi)∧[瘤組織，行鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法(SP)HIF-1α免疫組織化學(xué)。HIF-1α表達(dá)量判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)染成棕黃色為HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性，每個(gè)免疫組織化學(xué)著色成功的標(biāo)本均在400倍高倍鏡下，選取5個(gè)互不重疊的視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比2次，取兩次平均值作為該視野的HIF-1α表達(dá)量，最后以5個(gè)視野HIF-1α表達(dá)量的平均值作為該標(biāo)本的HIF-1α表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.199Tcm-MNLS、99Tcm-HL91的質(zhì)量控制 標(biāo)記后的99Tcm-MNLS、99Tcm-HL91均為無(wú)色透明溶液；室溫下放置10 min，其放射化學(xué)純度均大于90%。

2.2 放療后99Tcm-MNLS、99Tcm-HL91乏氧顯像99Tcm-MNLS組即刻顯像組T/NT比值(3.36±0.20)均較其48 h顯像組(2.25±0.43)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.44，P<0.05)；99Tcm-HL91組即刻顯像組T/NT比值(3.23±0.90)均較其48 h顯像組(2.79±0.85)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.99，P<0.05)；99Tcm-MNLS和99Tcm-HL91組即刻顯像組T/NT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.58，P>0.05)；48 h顯像組T/NT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.31，P>0.05)；99Tcm-MNLS顯像在腹部除腎臟外無(wú)明顯濃集，而99Tcm-HL91全腹均有濃集。99Tcm-MNLS與99Tcm-HL91均能探測(cè)荷瘤小鼠腫瘤放療后腫瘤乏氧狀態(tài)變化，在探測(cè)腹部腫瘤方面99Tcm-MNLS可能優(yōu)于99Tcm-HL91，見(jiàn)圖1。

2.3 各組荷瘤小鼠腫瘤HIF-1α免疫組織化學(xué)檢測(cè)99Tcm-MNLS組即刻顯像組HIF-1α表達(dá)量(88.55±0.83)%均較其48 h顯像組(22.75±3.35)%增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.78，P<0.05)；99Tcm-HL91組即刻顯像組HIF-1α表達(dá)量(90.55±2.61)%均較其48 h顯像組(25.88±3.76)%增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.92，P<0.05)；99Tcm-MNLS和99Tcm-HL91組即刻顯像組HIF-1α表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.33，P>0.05)；48 h顯像組T/NT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.19，P>0.05)，見(jiàn)圖2。

A：99Tcm-MNLS放療后即刻顯像組；B：99Tcm-MNLS放療后48 h顯像組；C：99Tcm-HL91放療后即刻顯像組；D：99Tcm-HL91放療后48 h顯像組；箭頭：腫瘤部位。

圖1 放療后即刻99Tcm-MNLS和99Tcm-HL91顯像結(jié)果

A:放療后即刻組；B：放療后48 h組。

圖2 放療后HIF-1α免疫組織化學(xué)結(jié)果(SP×200)

3 討 論

3.1 乏氧顯像劑攝取機(jī)制 放射性核素乏氧顯像劑分為硝基咪唑類和非硝基咪唑類，其中硝基咪唑類乏氧顯像劑的顯像機(jī)制為其在細(xì)胞內(nèi)以黃嘌呤氧化酶為主的細(xì)胞內(nèi)酶的作用下發(fā)生單電子還原，產(chǎn)生陰離子自由基；該陰離子自由基在正常細(xì)胞中被迅速氧化成原物質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞膜，擴(kuò)散到細(xì)胞外，但在乏氧細(xì)胞中，因沒(méi)有足夠的氧，陰離子自由基不能被氧化還原而與細(xì)胞內(nèi)組分結(jié)合滯留在細(xì)胞內(nèi)[8-9]，本實(shí)驗(yàn)中的新合成乏氧顯像劑99Tcm-MNLS為硝基咪唑類乏氧顯像劑，99Tcm-HL91為非硝基咪唑類乏氧顯像劑，通過(guò)自身發(fā)生氧化還原反應(yīng)，除氧化還原基團(tuán)不同外，其攝取機(jī)制與硝基咪唑類乏氧顯像劑類似，這可能與其高滲透性及其高氧化還原電位有關(guān)，高滲透性便于其快速到達(dá)細(xì)胞內(nèi)線粒體，而高氧化還原電位促進(jìn)其氧化還原，且有研究表明無(wú)硝基咪唑的核心配基復(fù)合體具有更高的乏氧選擇性。

而本研究中乏氧顯像劑99Tcm-MNLS和99Tcm-HL91在監(jiān)測(cè)放療后腫瘤內(nèi)乏氧狀態(tài)變化方面效果相近，但在腹部99Tcm-HL91全腹均見(jiàn)放射性濃集，而99Tcm-MNLS僅見(jiàn)腎臟和膀胱顯像，這可能與兩種顯像劑的排泄方式有關(guān)：99Tcm-MNLS 主要通過(guò)腎臟排泄，而99Tcm-HL91主要由肝膽、腸道與腎臟排泄。因此，在腹部腫瘤顯像方面99Tcm-MNLS乏氧顯像可能有更大的發(fā)展前途。

3.2 HIF-1α表達(dá)與腫瘤乏氧程度的相關(guān)性 HIF-1α是腫瘤組織在乏氧環(huán)境下對(duì)乏氧產(chǎn)生應(yīng)答的最基本的調(diào)控因子，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、治療及預(yù)后密切相關(guān)[10-12]，反映腫瘤內(nèi)乏氧狀態(tài)的變化。研究顯示，大部分腫瘤乏氧組織中都有不同程度的HIF-1α表達(dá)，且其表達(dá)量乏氧程度的不同有明顯的變化明顯不同，乏氧程度越重，HIF-1α表達(dá)量越高[13]；HIF-1α表達(dá)量與腫瘤乏氧顯像結(jié)果有很好的相關(guān)性[14]。HIF-1α的乏氧特性可應(yīng)用于分子靶向核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以研制新型的99Tcm標(biāo)記HIF-1α相關(guān)分子探針探測(cè)腫瘤乏氧，也可應(yīng)用于腫瘤放、化療領(lǐng)域靶向治療腫瘤，有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)利用HIF-1α免疫組織化學(xué)從組織學(xué)角度反映放療后腫瘤內(nèi)乏氧狀態(tài)的變化，且99Tcm-MNLS、99Tcm-HL91乏氧顯像所示的腫瘤部位的乏氧狀態(tài)的變化與HIF-1α免疫組織化學(xué)結(jié)果相符，說(shuō)明99Tcm-MNLS、99Tcm-HL91乏氧顯像能真實(shí)地反映腫瘤內(nèi)組織乏氧狀態(tài)的變化。

綜上所述，99Tcm-MNLS、99Tcm-HL91腫瘤乏氧顯像均能真實(shí)地反映腫瘤內(nèi)乏氧狀態(tài)的變化，適用于腫瘤乏氧的檢測(cè)及監(jiān)測(cè)腫瘤放療后其乏氧狀態(tài)的變化，有望成為無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)腫瘤組織乏氧程度及范圍最有效的手段，并為腫瘤分割照射時(shí)間的確定提供有力依據(jù)，尤其是在腹部腫瘤方面，99Tcm-MNLS有較大的優(yōu)勢(shì)，有可能成為SPECT/CT腹部腫瘤顯像的乏氧顯像劑，解決腹部腫瘤難以鑒別的難題，值得進(jìn)一步研究。

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Comparison between99Tcm-MNLS and99Tcm-HL91 in assessing the hypoxia of the tumor after radiotherapy

HuYujing,BianYanzhu△,ZhangWenyan,WuDayong,WeiQiang

(DepartmentofNuclearMedicine,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang,Hebei050051,China)

Objective To compare the imaging of99Tcm-MNLS and99Tcm-HL91 for the hypoxic assessment in the tumor after radiotherapy.Methods Twenty four Kunming mice models bearing H22 liver cancer xenografts which tumor were treated radiotherapy for 25 Gy were divided into99Tcm-MNLS instant group,99Tcm-MNLS 48 h group,99Tcm-HL91 instant group,99Tcm-HL91 48 h group and injected the matching99Tcm-MNLS or99Tcm-HL91 to image.The technique of ROI was adopted to calculated the T/NT on the image.Immunohistochemical stain methods were used to evaluate the level of HIF-1α about tumors after imaging.Two samplettest was performed.Results The T/NT and the HIF-1α level about instant (3.36±0.20,88.55%±0.83%)were higher than and 48 h (2.25±0.43,22.75%±3.35%)in99Tcm-MNLS group(P<0.05),then in99Tcm-HL91 group the T/NT and the HIF-1α level about instant (3.23±0.90,90.55%±2.61%)were higher than 48 h (2.79±0.85,25.88%±3.76%)(P<0.05).The difference of T/NT,HIF-1α level about instant in99Tcm-MNLS group and99Tcm-HL91 group were no significant(P>0.05)and the same to the T/NT,HIF-1α level about 48h in99Tcm-MNLS group and99Tcm-HL91 group(P>0.05).Conclusion99Tcm-MNLS hypoxia imaging could provide the change of hypoxia comparable to99Tcm-HL91,and the two radiopharmaceutical could both show high accuracy rate in evaluating the hypoxia in the tumor.

metronidazole;technetium;anoxia;liver neoplasms;mice;radionuclide imaging;HIF-1α

胡玉敬(1984-),醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤核醫(yī)學(xué)方面的研究。

△通訊作者，Tel:13073129364；E-mail:yanzhubian90@163.com。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.19.009

R817.1

A

1671-8348(2015)19-2618-03

2014-11-18

2015-03-10)