基于羅丹明B的激活型α－酮戊二酸熒光探針

焦長(zhǎng)紅，何 業(yè)，靳鵬偉，朱世琴，朱為宏＊

（1．華東理工大學(xué) 精細(xì)化工研究所，上海200237；2．華東理工大學(xué) 科技信息研究所，上海200237）

近年來，人們?cè)O(shè)計(jì)了許多熒光傳感器用于生物體的檢測(cè)［1－4］，例如唾液酸、線粒體及血清蛋白含量的變化都可以通過熒光技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)［5，6］。醫(yī)學(xué)工作者可以通過檢測(cè)特征標(biāo)志物含量的變化來檢測(cè)某些疾病，急性骨髓性白血病 （AML）就是其中一種，其主要臨床表現(xiàn)為骨髓內(nèi)異常細(xì)胞的快速增殖影響了正常血細(xì)胞的產(chǎn)生，以面色蒼白、發(fā)熱、身困無力為主要特征，并伴有心悸、氣短、胸脅壓痛和關(guān)節(jié)痛等［7，8］。AML的發(fā)病率隨著年齡增長(zhǎng)而增大［9］，故建立一種快速檢測(cè)該類疾病的方法十分重要。

研究發(fā)現(xiàn)，許多AML都是由于異檸檬酸脫氫酶－1（IDH1）及異檸檬酸脫氫酶－2（IDH2）突變引起，該突變將導(dǎo)致α－酮戊二酸 （α－KA）轉(zhuǎn)變?yōu)?－羥基戊二酸 （2HG），因此檢測(cè)α－KA轉(zhuǎn)變?yōu)?HG的過程具有十分重要的意義［10，11］?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法一般通過液質(zhì)聯(lián)用 （LC－MS）或核磁共振 （NMR）來檢測(cè)2HG含量的變化，進(jìn)而確定IDH的突變［12，13］，但其昂貴的測(cè)試成本及繁瑣的樣本預(yù)處理過程使其無法得到廣泛的應(yīng)用。2HG由于化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有易于檢測(cè)的特征官能團(tuán)，直接檢測(cè)十分困難，而α－KA 的羰基被鄰位強(qiáng)吸電子的羧基活化，因此本文的出發(fā)點(diǎn)就是通過檢測(cè)活性羰基來檢測(cè)α－KA含量的變化。

熒光檢測(cè)以其高靈敏度、高選擇性、非破壞性等優(yōu)點(diǎn)受到越來越多的關(guān)注［14－18］。羅丹明由于具有熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、摩爾消光系數(shù)高、激發(fā)波長(zhǎng)及發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在熒光探針中被廣泛應(yīng)用［19－23］。針對(duì)傳統(tǒng)測(cè)試條件的不足，本文合成了一個(gè)含有肼基作為響應(yīng)基團(tuán)的羅丹明B衍生物熒光傳感器RBN（圖1）。其識(shí)別機(jī)理是，RBN本身是閉環(huán)的結(jié)構(gòu)沒有熒光，但水合肼可以與α－KA的活性羰基發(fā)生反應(yīng)生成Schiff堿，所生成Schiff堿的酞胺螺環(huán)的吸電子能力增強(qiáng)，誘導(dǎo)開環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致RBN熒光增強(qiáng)（圖2）。為了選擇一個(gè)合適的測(cè)試條件，既可以使RBN對(duì)α－KA有較強(qiáng)的熒光響應(yīng)，又使測(cè)試在接近人體中性環(huán)境下進(jìn)行，進(jìn)一步對(duì)測(cè)試條件進(jìn)行了系列優(yōu)化。以加入α－KA前RBN熒光強(qiáng)度為I0，與α－KA反應(yīng)后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度作為I，通過比較反應(yīng)后熒光增強(qiáng)倍數(shù)（I／I0），對(duì)檢測(cè)溫度、pH、響應(yīng)時(shí)間等測(cè)試條件進(jìn)行了系列優(yōu)化。此外，用人體內(nèi)常見的氨基酸、化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的羰基化合物及活性氧化物（ROS）作參比，RBN對(duì)α－KA均表現(xiàn)出很好的選擇性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖1 熒光探針RBN的合成

圖2 熒光探針RBN檢測(cè)α－KA的原理

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

核磁共振氫譜和碳譜的測(cè)定采用了Bruker Avance超導(dǎo)傅里葉變換核磁共振波譜儀（400 MHz），室溫下以TMS為內(nèi)標(biāo)測(cè)定；質(zhì)譜的測(cè)試儀器為 Waters LCT Premier XE spectrometer；紫外－可見光吸收光譜的測(cè)定采用了Varian Cary 100紫外－可見分光光度計(jì)；熒光發(fā)射光譜為Varian Cary Eclipse熒光光譜儀測(cè)定；熒光動(dòng)力學(xué)曲線所用儀器為海洋光學(xué)公司定制，其中所用光源為 Hamamatsu LC6Lightningcure，300W 汞氙燈提供，發(fā)射光譜由海洋光學(xué)CCD Maya2000pro跟蹤檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)測(cè)試所用試劑均為市售分析純?cè)噭?，羅丹明B購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，α－酮戊二酸及4－羥乙基哌嗪乙磺酸購自阿拉丁試劑有限公司。測(cè)試過程所用超純水是經(jīng)上海淶科儀器有限公司LAKECORE－S040D型超純水器凈化處理的蒸餾水。不同pH的HEPES緩沖溶液是在2mmol·L－1的4－羥乙基哌嗪乙磺酸的超純水溶液中滴加1mol·L－1的氫氧化鈉水溶液，用pH計(jì)實(shí)時(shí)測(cè)量，調(diào)節(jié)pH為5．7～7．0。RBN母液是500μmol·L－1的RBN的二甲基亞砜溶液，α－KA母液的濃度是10mmol·L－1，溶劑為超純水。

1．2 探針RBN的合成

在100mL單口燒瓶中，加入羅丹明B（1．2g，2．5mmol）、水合肼（3mL）和乙醇（30mL），氬氣保護(hù)下油浴加熱至80～90℃回流反應(yīng)3h，減壓下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到淺紫色固體。加入1mol·L－1的稀鹽酸（50mL）使固體全部溶解，再用1mol·L－1的氫氧化鈉水溶液（100mL）調(diào)節(jié)pH至7～8，有粉色固體析出，抽濾，所得固體經(jīng)10mL乙醇重結(jié)晶，得淡粉色固體粉末0．9g，產(chǎn)率84．0%［24］。

1HNMR （400MHz，CDCl3）：1．16（t，12H，—NCH2CH3，J＝7．2Hz），3．33（q，8H，—NCH2－CH3，J＝7．2Hz），3．60（br，2H，—NH2），6．28（dd，2H，phenyl－H，J1＝8．8Hz，J2＝2．0Hz），6．41（d，2H，phenyl－H，J＝2．0Hz），6．45（d，2H，phenyl－H，J＝8．8Hz），7．10（t，1H，phenyl－H，J＝3．6Hz），7．44（t，2H，phenyl－H，J＝3．6Hz），7．93（t，1H，phenyl－H，J＝3．6Hz）．13CNMR（100MHz，CDCl3）：12．62，44．38，65．96，97．95，104．50，108．04，123．01，123．84，128．11，128．14，130．00，132．55，148．89，151．56，153．86，166．19．HRMS （ESI）：calcd for C28H32－N4O2［M＋H］＋：457．2604，found 457．2595。

2 結(jié)果與討論

2．1 探針RBN對(duì)α－KA的滴定曲線

取2mL HEPES緩沖溶液 （pH ＝ 6．1），加入40μL的RBN母液，保持檢測(cè)溫度為37．4℃，通過熒光光譜儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為558nm時(shí)，檢測(cè)α－KA的加入對(duì)產(chǎn)物熒光變化的影響（圖3）。隨著α－KA的不斷加入，其熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，表現(xiàn)出很好的線性關(guān)系。其機(jī)理可以認(rèn)為是，RBN本身是閉環(huán)結(jié)構(gòu)，沒有熒光，但隨著α－KA的加入會(huì)促進(jìn)羅丹明B螺環(huán)部位發(fā)生開環(huán)，使羅丹明B整體的共軛結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致RBN熒光增強(qiáng)（圖2）［25－28］。隨著α－KA 的加入，探針 RBN 的紫外吸收光譜圖也表現(xiàn)出明顯變化（圖4）。這是由于RBN自身是閉環(huán)結(jié)構(gòu)，由于空間構(gòu)型扭曲，芳香環(huán)之間沒有形成共軛結(jié)構(gòu)，在450～650nm之間幾乎沒有紫外吸收。當(dāng)RBN與100eq的α－KA反應(yīng)后，在450～650nm之間表現(xiàn)出明顯的吸收峰，且最大吸收峰為558nm，這是由于α－KA使RBN開環(huán)導(dǎo)致共軛結(jié)構(gòu)增大。此外，探針RBN與α－KA反應(yīng)產(chǎn)物的高分辨率質(zhì)譜的分子離子峰［M＋H］＋出現(xiàn)在585．2710，這與對(duì)應(yīng)的開環(huán)體的理論值（585．2713）非常一致，也進(jìn)一步證明了Schiff堿的生成使RBN發(fā)生開環(huán)的機(jī)理。

圖3 RBN與不同濃度α－KA反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜圖插圖是585nm處I／I0隨α－KA當(dāng)量的變化曲線

2．2 探針RBN測(cè)試條件的優(yōu)化

圖4 探針RBN與α－KA作用前后的紫外吸收光譜圖

反應(yīng)體系的pH是影響反應(yīng)速率的重要因素之一。為了選擇一個(gè)合適的pH環(huán)境，進(jìn)行了一系列平行檢測(cè)，以比較不同pH下RBN與α－KA反應(yīng)生成Schiff堿的熒光變化。在37．4℃的檢測(cè)溫度下，向不同pH的 HEPES緩沖溶液（2 mL）中加入40μL的RBN母液，使用558nm的光激發(fā)，同樣通過熒光光譜儀分別測(cè)試加入α－KA（20μL）前后溶液的熒光，得到585nm 處I／I0隨pH的變化曲線（圖5）。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH大于6．1時(shí)，隨著pH值的增大，產(chǎn)物的熒光增長(zhǎng)倍數(shù)持續(xù)減小，這是由于酸性減弱不利于生成Schiff堿反應(yīng)的發(fā)生。但由于羅丹明B在強(qiáng)酸性情況下容易發(fā)生自身的開環(huán)反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致RBN自身熒光增強(qiáng)（I0變大），因此測(cè)試環(huán)境的pH不能無限制的減小。事實(shí)上，實(shí)驗(yàn)證明在pH小于6．1后，產(chǎn)物的熒光增強(qiáng)倍數(shù)開始變得不明顯，這是由于檢測(cè)體系酸性太強(qiáng)，使RBN開環(huán)導(dǎo)致其自身熒光I0增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致熒光增強(qiáng)倍數(shù)變化不明顯?？紤]到在pH接近中性的條件下，測(cè)試環(huán)境更接近于人體體液的特點(diǎn)，同時(shí)pH為5．7～6．1時(shí)RBN熒光增強(qiáng)倍數(shù)十分接近，故在后面系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中選擇在更靠近中性環(huán)境（pH＝6．1）的體系中進(jìn)行。

反應(yīng)時(shí)間是影響探針性能的另外一個(gè)重要因素，可以通過在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RBN與α－KA反應(yīng)生成Schiff堿的熒光變化來評(píng)價(jià)響應(yīng)速度。在溫度為37．4℃的環(huán)境下，向2mL HEPES緩沖溶液（pH＝6．1）中加入40μL的 RBN母液，再加入20μL的α－KA，使用波長(zhǎng)為558nm的光激發(fā)，測(cè)試在585nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線（圖6），發(fā)現(xiàn)探針RBN與α－KA的反應(yīng)非常迅速，僅1．25s后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度就達(dá)到平衡，這明顯優(yōu)于目前報(bào)道的關(guān)于檢測(cè)α－KA的熒光探針的響應(yīng)時(shí)間（需1h以上）［4］，而RBN將反應(yīng)時(shí)間縮短到1．25s，瞬間內(nèi)即可完成反應(yīng)，極大程度地提高了檢測(cè)的效率，有利于在線快速檢測(cè)，具有很大的應(yīng)用潛能。

圖5 在585nm處熒光強(qiáng)度（I／I0）隨pH的變化曲線

圖6 在585nm處RBN熒光動(dòng)力學(xué)曲線

由于RBN與α－KA的反應(yīng)是典型的生成Schiff堿的反應(yīng)，反應(yīng)體系的溫度也可能對(duì)反應(yīng)速率有重要影響。因此進(jìn)行了一系列平行實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)溫度變化對(duì)反應(yīng)速率的影響。采用上面優(yōu)化的pH、響應(yīng)時(shí)間，即取2mL HEPES緩沖溶液（pH＝6．1），加入40μL的 RBN 母液及20μL的α－KA，通過熒光光譜儀測(cè)試溫度在5～45℃范圍內(nèi)的熒光變化（圖7）。很明顯，RBN與α－KA反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨溫度變化并不明顯，因此在后續(xù)的測(cè)試中選擇在人體溫度即37．4℃條件下進(jìn)行，有利于后期實(shí)際應(yīng)用。

圖7 在585nm處I／I0隨溫度的變化曲線

經(jīng)過上述一系列對(duì)反應(yīng)溫度、pH、響應(yīng)時(shí)間等條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)溫度為37．4℃、pH為6．1的HEPES緩沖溶液中，RBN與α－KA響應(yīng)非常迅速，僅需1．25s即可達(dá)到檢測(cè)平衡。在下面測(cè)試中采用優(yōu)化后的條件，進(jìn)一步探討探針RBN對(duì)α－KA的選擇性。

2．3 探針RBN的選擇性研究

由于α－KA存在于人體體液中，同時(shí)體液中還存在許多其它種類的氨基酸，所以選擇了L－精氨酸（Arg）、L－纈氨酸（Val）、L－組氨酸（His）、甘氨酸（Ami）、L－絲氨酸（Ser）、L－甲硫氨酸（Met）、DL－丙氨酸（Ala）、L－亮氨酸（Leu）、L－酪氨酸（Tyr）、L－脯氨酸（Pro）、L－蘇氨酸（Thr）、L－色氨酸（Trp）、L－苯丙氨酸（Phe）、L－谷氨酸（Glu）、L－谷氨酰胺（Gln）、肌氨酸（Sar）、L－天門冬氨酸（Asp）、DL－天冬酰胺（Asn）、L－異亮氨酸（Ile）和 DL－半胱氨酸（Cys）20種常見氨基酸與α－KA進(jìn)行對(duì)比測(cè)試。檢測(cè)溫度為37．4℃，在pH為6．1的HEPES緩沖溶液中加入RBN母液，然后分別加入α－KA或20種常見氨基酸，采用558nm激發(fā)，585nm下檢測(cè)產(chǎn)物的熒光。如圖8所示，測(cè)試發(fā)現(xiàn)探針RBN只有與α－KA反應(yīng)產(chǎn)物的熒光有明顯的增強(qiáng)，與20種常見氨基酸反應(yīng)產(chǎn)物的熒光幾乎無變化，表明探針RBN即使在各種氨基酸存在的環(huán)境中對(duì)α－KA也有很好的選擇性。

除上述20種常見氨基酸外，還有一些化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的羰基化合物及ROS可能會(huì)對(duì)RBN的選擇性產(chǎn)生干擾。因此選擇丙酮酸鈉（PAS）、乙二醛（GO）、3－苯丙醇（PGO）、丙酮醛（MGO）、苯丙酮酸（PPA）、過氧化氫（H2O2）等幾種化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)測(cè)試其選擇性。在與上述氨基酸相同條件下檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，除了RBN對(duì)PAS有微弱的響應(yīng)之外，只有α－KA與RBN反應(yīng)產(chǎn)物的熒光有明顯增強(qiáng)（圖9），這說明RBN對(duì)α－KA有很好的選擇性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

圖9 探針RBN基于不同羰基化合物及ROS的熒光選擇性測(cè)試

基于傳統(tǒng)的Schiff堿反應(yīng)，設(shè)計(jì)合成了一個(gè)含有羅丹明B的熒光探針RBN以檢測(cè)α－KA。經(jīng)過一系列的平行實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了RBN與α－KA的反應(yīng)條件，最后選定在pH為6．1的HEPES緩沖溶液中，檢測(cè)溫度為37．4 ℃，RBN 的濃度 為10μmol·L－1，檢測(cè)響應(yīng)時(shí)間僅1．25s。在相同的條件下，本文還采用20種常見氨基酸、化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的羰基化合物及ROS進(jìn)行了選擇性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)RBN對(duì)α－KA表現(xiàn)出很好的選擇性。和傳統(tǒng)的高效液相及核磁共振檢測(cè)α－KA的方法相比，RBN更加方便、經(jīng)濟(jì)、快捷，為血清等體液檢測(cè)提供了可能，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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