維A酸軟膏中維A酸的含量測(cè)定及有關(guān)物質(zhì)的檢查

蔡 樂(lè)，姚 蘭，白 林（解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 100853）

·實(shí)驗(yàn)研究·

維A酸軟膏中維A酸的含量測(cè)定及有關(guān)物質(zhì)的檢查

蔡 樂(lè)，姚 蘭，白 林（解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 100853）

目的：建立維A酸軟膏中維A酸的含量測(cè)定及有關(guān)物質(zhì)檢查的方法。方法：采用HPLC法測(cè)定維A酸的含量。色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-2%冰醋酸（85 : 15），流速：1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：354 nm，柱溫：45 ℃。結(jié)果：維A酸與其他雜質(zhì)分離良好，與異維A酸的分離度＞ 5。維A酸在0.934 4 ～ 18.687 2 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r = 1.000 0）；維A酸的平均回收率為99.4%（RSD = 1.44%，n = 9）。結(jié)論：采用該方法測(cè)定維A酸軟膏中維A酸的含量操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜法；維A酸軟膏；含量測(cè)定；維A酸；異維A酸

維A酸軟膏收載于《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）[1]，由維A酸、凡士林和液體石蠟組成，其中維A酸是維生素A的活性代謝產(chǎn)物，具有促進(jìn)表皮細(xì)胞更新、調(diào)節(jié)表皮細(xì)胞增殖和分化作用，該藥常用于各種類型的扁平苔蘚、毛囊角化病、痤瘡及其他角化異常類皮膚病的治療。在《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）中并未記載維A酸軟膏的含量測(cè)定方法，維A酸不穩(wěn)定見光易轉(zhuǎn)化為其順勢(shì)異構(gòu)體異維A酸，為提高維A酸軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更好地控制該制劑的質(zhì)量，提高臨床用藥的安全性和有效性，本研究建立了測(cè)定維A酸軟膏中維A酸的含量及檢查有關(guān)物質(zhì)異維A酸的HPLC方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括1200系列在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測(cè)器和色譜工作站，美國(guó)Agilent公司）；AG-285型電子天平（瑞士Mettler公司）；UV-2550型紫外分光光度儀（日本島津公司）。

維A酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.4%，批號(hào)100224-200903）；異維A酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.8%，批號(hào)100224-200903）；維A酸軟膏（本院自制，規(guī)格：0.025%、20 g/盒，批號(hào)20140120-1、20140120-2、20140121）；甲醇為色譜純；乙醇、冰醋酸為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-2%冰醋酸（85 : 15）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：354 nm；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液 精密稱定維A酸對(duì)照品9.4 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱定異維A酸對(duì)照品12.3 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為異維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液A。精密量取異維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液A 1 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為異維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液B。精密量取維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL和異維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液B 4 mL，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（含維A酸2.335 9 μg·mL-1和異維A酸0.491 0 μg·mL-1）。

2.2.2供試品溶液 避光操作，取供試品約1.0 g（含維A酸約0.25 mg），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無(wú)水乙醇50 mL，稱定重量，于60 ℃水浴中充分振搖15 min，再置于冰浴中冷卻2 h。取出后用無(wú)水乙醇補(bǔ)足重量，迅速濾過(guò)，放至室溫后，取續(xù)濾液5 mL置10 mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液 另按處方比例及制備工藝，取除維A酸以外的其余成分，配制不含維A酸的空白制劑，依供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定HPLC圖譜，考察供試品中維A酸、異維A酸和其他組分色譜峰分離情況。在此色譜條件下，維A酸的保留時(shí)間為18.4 min，異維A酸的保留時(shí)間為16.3 min，維A酸和異維A酸色譜峰峰形對(duì)稱尖銳，分離度大于5，基線平穩(wěn)，與其他色譜峰分離良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取維A酸儲(chǔ)備液適量，加流動(dòng)相配制成含維A酸分別為0.934 4、2.335 9、4.671 8、9.343 6、14.015 4、18.687 2 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得維A酸的回歸方程為Y = 89.383 X + 1.874 2，r = 1.000 0。結(jié)果表明，維A酸在0.934 4 ～18.687 2 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖1 維A酸軟膏的HPLC色譜圖A – 陰性對(duì)照，B – 對(duì)照品，C – 供試品；1 – 異維A酸，2 – 維A酸Fig 1 HPLC chromatogram of tretinoin ointmentA – negative reference substance, B – reference substance, C – sample; 1 – isotretinoin, 2 – tretinoin

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，計(jì)算維A酸的峰面積RSD為0.06%（n = 6），表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)20140120-1）約1.0 g，共6份，精密稱定，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量RSD為1.73%（n = 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下空白制劑9份，分成3組，每組3份，每份約1.0 g。分別精密加入一定量的維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，于50 ℃微溫下與空白制劑混合，再按供試品溶液制備方法制成含量約為供試品標(biāo)示量的80%、100%、120%的樣品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 維A酸軟膏回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果.n= 9Tab 1 Results of recovery test about tretinoin ointment.n= 9

2.8 樣品含量測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)20140120-1、20140120-2、20140121），每批3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算各個(gè)樣品中維A酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 維A酸軟膏中維A酸的含量.n= 3Tab 2 Determination of contents of tretinoin in tretinoin ointment.n= 3

2.9 異維A酸限量檢查

取3批樣品（批號(hào)20140120-1、20140120-2、20140121），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，40 μL進(jìn)樣測(cè)定。供試品溶液色譜圖中若有與異維A酸保留時(shí)間一致的色譜峰，其峰面積不得大于對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣時(shí)異維A酸峰面積的5%。經(jīng)測(cè)定，3批樣品異維A酸的限量均符合規(guī)定。

3 討論

3.1 維A酸含量測(cè)定方法的選擇

維A酸的含量測(cè)定方法主要有UV法[2-3]和HPLC法[4-6]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，維A酸軟膏中凡士林等基質(zhì)和異維A酸等雜質(zhì)在維A酸最大吸收波長(zhǎng)處均有吸收，對(duì)紫外分光光度法測(cè)定存在影響，采用HPLC法則可避免基質(zhì)和雜質(zhì)對(duì)維A酸測(cè)定的干擾，并可對(duì)制劑中的雜質(zhì)進(jìn)行限量檢查。由于軟膏基質(zhì)黏度大，成分復(fù)雜，處理不當(dāng)易造成色譜柱堵塞。因此，本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，對(duì)提取條件等進(jìn)行了優(yōu)化。

3.2 色譜條件的選擇

研究中曾參考文獻(xiàn)[6]維A酸原料藥含量測(cè)定項(xiàng)下的流動(dòng)相甲醇-2%冰醋酸（81 : 19）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但采用該配比測(cè)定時(shí)維A酸的出峰時(shí)間偏長(zhǎng)（約30 min），且峰形寬。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)維A酸對(duì)甲醇的比例變化敏感，維A酸在甲醇-2%冰醋酸（90∶10）的條件下，出峰時(shí)間可縮短為10 min左右，但維A酸與異維A酸的分離度 ＜ 5；而維A酸在甲醇-2%冰醋酸（85∶15）的條件下，出峰時(shí)間為18 min左右，維A酸與異維A酸的分離良好（分離度 ＞ 5），為此確定流動(dòng)相為甲醇-2%冰醋酸（85∶15）。通過(guò)掃描維A酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外圖譜，發(fā)現(xiàn)維A酸在354 nm處有最大吸收，因此選擇354 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取條件的選擇

本研究分別以無(wú)水乙醇、甲醇和流動(dòng)相作為溶劑提取樣品，發(fā)現(xiàn)無(wú)水乙醇的提取率明顯高于甲醇和流動(dòng)相。為減小供試品溶液對(duì)色譜柱的損壞，使用無(wú)水乙醇提取后，可冰浴2 h使軟膏基質(zhì)沉淀，濾過(guò)后再用流動(dòng)相稀釋進(jìn)一步析出雜質(zhì)，最后用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后進(jìn)樣[7]。此外，對(duì)提取時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)60 ℃水浴時(shí)充分振搖15 min即可完全提取樣品。

3.4 維A酸的穩(wěn)定性

本研究考察了光線對(duì)維A酸穩(wěn)定性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，維A酸溶液在室溫光照條件下極不穩(wěn)定，1 h含量下降近20%，8 h含量下降超過(guò)60%；而維A酸在室溫避光條件下，12 h基本穩(wěn)定，因此實(shí)驗(yàn)操作中要注意嚴(yán)格避光。

由于維A酸不穩(wěn)定，見光易轉(zhuǎn)化為異維A酸，而異維A酸具有較強(qiáng)的致畸作用，因此應(yīng)對(duì)制劑中異維A酸的含量進(jìn)行限制。參考文獻(xiàn)[6]維A酸乳膏中的檢查方法，本研究將供試品40 μL進(jìn)樣中異維A酸峰面積限定為不大于對(duì)照品溶液（10 μL進(jìn)樣）中異維A酸峰面積的5%，經(jīng)檢查所配制的3批樣品均符合規(guī)定。

綜上，采用HPLC法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，可作為維A酸軟膏中維A酸含量測(cè)定及有關(guān)物質(zhì)檢查的方法。

[1] 中國(guó)人民解放軍總后勤衛(wèi)生部.中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范（2002年版）[S].北京：人民軍醫(yī)出版社，2003：166.

[2] 姜武民，黃波.維A酸乳膏(0.025%)含量測(cè)定方法的探究[J].實(shí)用藥物與臨床，2011，14（3）：229-230.

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[7] 蔡樂(lè)，白林，徐風(fēng)華，等.HPLC法測(cè)定薄荷苯酚軟膏中苯酚的含量[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2014，11（2）：82-84.

Determination of tretinoin and its related substance in tretinoin ointment

CAI Le, YAO Lan, BAI Lin(Department of Pharmaceutical Care, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective:To establish the HPLC method for determination of tretinoin and its related substance in tretinoin ointment.Methods:HPLC analysis was carried out on a column of Agilent Zorbax SB C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with mobile phase consisted of methanol -2% glacial acetic acid solution (85 : 15), the flow rate was 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was set at 354 nm and column temperature was 45 ℃.Results:The separation between tretinoin and other impurities was well under this chromatographic condition, and separating degree of tretinoin and isotretinoin was ＞ 5. The calibration curve of tretinoin was linear in the ranger of 0.934 4 – 18.687 2 μg·mL-1(r = 1.000 0). The average recovery of tretinoin was 99.4% (RSD = 1.44%, n = 9).Conclusion:This method is simple, accurate and feasible, which can be applied as the quantitative method for the determination of tretinoin in tretinoin ointment.

HPLC; Tretinoin ointment; Content determination; Tretinoin; Isotretinoin

R917

A

1672 – 8157(2015)03 – 0144 – 03

2014-09-08

2015-01-20）

軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)重點(diǎn)課題：半固體制劑標(biāo)準(zhǔn)提高系列研究（13ZJZ05）

白林，女，主任藥師，研究方向：藥物分析、醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：bailin301@126.com

蔡樂(lè)，男，主管藥師，主要從事藥物分析、醫(yī)院藥學(xué)工作。E-mail：caile15009@163.com