高效液相色譜法測(cè)定霉茶成分及其對(duì)血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶的抑制作用*

吳勇，羅弘，王瑞，譚永霞，胡俊杰，張寶徽，田先翔，鄭國(guó)華，張?bào)愕t

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；2.中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430065)

高效液相色譜法測(cè)定霉茶成分及其對(duì)血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶的抑制作用*

吳勇1，2，羅弘1，王瑞1，2，譚永霞1，2，胡俊杰1，2，張寶徽1，2，田先翔1，2，鄭國(guó)華1，2，張?bào)愕t1

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；2.中藥資源與中藥復(fù)方省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430065)

目的利用高效液相色譜法測(cè)定霉茶成分對(duì)血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制作用。方法以馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)為反應(yīng)底物，經(jīng)ACE催化生成的馬尿酸為測(cè)定指標(biāo)，分別考察霉茶總黃酮、二氫楊梅素、楊梅素對(duì)ACE的抑制作用。采用Welchrom C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為水(含0.1%甲酸，0.1%三乙胺)：乙腈(含0.1%甲酸，0.1%三乙胺)=78：22，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果馬尿酸在0.05～5.00 μg范圍內(nèi)其進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，霉茶總黃酮、二氫楊梅素對(duì)ACE抑制率>75%。結(jié)論經(jīng)該法檢測(cè)，霉茶總黃酮、二氫楊梅素對(duì)ACE均有較強(qiáng)抑制作用。該方法簡(jiǎn)單、靈敏、重復(fù)性好，可用于ACE抑制藥的體外活性篩選。

霉茶成分；血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶；抑制作用；含量測(cè)定；色譜法，高效液相

血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)主要參與調(diào)節(jié)腎素-血管緊張肽-醛甾酮系統(tǒng)。其作用主要使血管緊張肽Ⅰ(angiotensinⅠ)轉(zhuǎn)化成血管緊張肽Ⅱ(angiotensinⅡ)，而后者具有明顯的收縮血管作用，可使血壓升高。血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶活性提高，將導(dǎo)致血管緊張肽Ⅱ生成量增加，并使緩激肽鈍化，從而導(dǎo)致高血壓[1-2]。ACE的抑制藥已開(kāi)發(fā)成為臨床用于治療高血壓的一線藥物，如卡托普利、依那普利等。霉茶來(lái)源于葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄(AmpelopsisgrossedentataDiels et.Gilg)，具有清熱涼血的功效，對(duì)原發(fā)性高血壓、頭昏目脹等病癥具有較好的療效[3]。霉茶中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，其中二氫楊梅素和楊梅素為其主要的黃酮類(lèi)成分[4]。筆者采用高效液相色譜法測(cè)定霉茶總黃酮、二氫楊梅素、楊梅素對(duì)ACE的抑制作用，以對(duì)霉茶降血壓的有效成分進(jìn)行初步篩選。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Ultimate3000型，美國(guó)戴安公司)、UWD-3x00紫外檢測(cè)器、低溫高速離心機(jī)(CR21GⅡ型，HITACHI CENTRIFUGE日本Hitachi Koki Co.Ltd)、超級(jí)數(shù)顯恒溫水浴(501A型，上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠)、調(diào)速多用振蕩器(HY-4型，常州國(guó)華電器有限公司)、Eppendorf移液器(德國(guó)艾本德股份公司)。

1.2 試藥 卡托普利對(duì)照品和馬尿酸對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：100318-201103、140738-200501，含量>98%；ACE和馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL)(均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為：SLBD2091V，SLBC8836V)；二氫楊梅素對(duì)照品和楊梅素對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)分別為：091216，090531，含量>98%)；霉茶總黃酮由湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥劑研究室提供，從顯齒蛇葡萄的干燥莖葉提取制備，其采于湖北恩施自治州來(lái)鳳縣，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室陳科力教授鑒定為葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄(AmpelopsisgrossedentataDiels et.Gilg)；經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定總黃酮純度為71.45%，其中二氫楊梅素和楊梅素經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定純度分別為61.82%，5.29%；色譜乙腈(天津博迪化工股份有限公司)；三乙胺、甲醇、甲酸、硼酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Welchrom C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為水(含0.1%甲酸，0.1%三乙胺)：乙腈(含0.1%甲酸，0.1%三乙胺)= 78：22，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 測(cè)定原理 恒溫水浴時(shí)，HHL在ACE的催化下水解生成馬尿酸。實(shí)驗(yàn)組中ACE的活性受到血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制藥(angiotensin converting enzyme inhibition，ACEI)的抑制作用，生成的馬尿酸的量比對(duì)照組少。因此，可以通過(guò)測(cè)定馬尿酸的生成含量來(lái)評(píng)價(jià)ACEI對(duì)ACE活性的抑制率，計(jì)算公式為：R=(1-B/A)×100%，式中，R為ACEI樣品對(duì)ACE活性的抑制率，A為對(duì)照組生成馬尿酸的峰面積，B為實(shí)驗(yàn)組生成馬尿酸的峰面積。

2.3 溶液的配制 馬尿酸對(duì)照品溶液的制備：按所需濃度精密稱(chēng)取馬尿酸對(duì)照品適量，用雙蒸水稀釋制得馬尿酸對(duì)照品溶液。HHL溶液的配制：精密稱(chēng)取HHL粉末17.25 mg置5 mL量瓶中，以0.1 mol·L-1硼酸緩沖液(pH值=8.3，含0.3 mol·L-1氯化鈉) 溶解、稀釋至刻度線，得3.45 mg·mL-1HHL溶液?？ㄍ衅绽芤旱呐渲疲喊此铦舛染芊Q(chēng)取適量卡托普利對(duì)照品，用0.1 mol·L-1硼酸緩沖液(pH值=8.3，含0.3 mol·L-1氯化鈉)溶解、稀釋?zhuān)吹谩CE溶液的配制：將ACE 1 U置10 mL量瓶中，0.1 mol·L-1硼酸緩沖液(pH值=8.3，含0.3 mol·L-1氯化鈉)稀釋至刻度線，即得0.1 U·mL-1ACE溶液。樣品溶液的配制：精密稱(chēng)取霉茶總黃酮粉末適量，用0.1 mol·L-1硼酸緩沖液(pH值=8.3，含0.3 mol·L-1氯化鈉)溶解，再用相同緩沖溶液稀釋到所需濃度，制成樣品溶液；同法將二氫楊梅素和楊梅素加緩沖液制成相應(yīng)樣品溶液。

2.4 供試品的配制 空白對(duì)照組：用移液器分別吸取HHL溶液50 μL、緩沖溶液20 μL和ACE溶液10 μL置于0.5 mL離心管內(nèi)混勻。實(shí)驗(yàn)組：用移液器分別吸取HHL溶液50 μL、抑制藥溶液(卡托普利或霉茶成分) 20 μL、ACE溶液10 μL置0.5 mL離心管內(nèi)混勻?？瞻讓?duì)照組與實(shí)驗(yàn)組溶液在37 ℃恒溫水浴中反應(yīng) 40 min后，加入乙腈120 μL終止反應(yīng)，震蕩10 s后，10 000 r·min-1(r=250 mm)離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.5 高效液相色譜法分析 在“2.1”項(xiàng)條件下，ACE活性抑制反應(yīng)體系的高效液相色譜如圖1所示，馬尿酸保留時(shí)間約在5.4 min，保留時(shí)間較短，對(duì)篩選ACEI有利。馬尿酸的峰與相鄰峰之間分離度達(dá)到2.0以上，分離效果較好。空白對(duì)照組(圖1B)與實(shí)驗(yàn)組(圖1C)相比峰面積明顯增大，實(shí)驗(yàn)組幾乎檢測(cè)不到馬尿酸的峰，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組加入較高濃度的卡托普利后，ACE的活性受到明顯抑制。

2.6 線性關(guān)系及檢測(cè)限 取濃度為1 000.0 μg·mL-1馬尿酸對(duì)照品，加雙蒸水稀釋成500.0，100.0，50.0，12.5，5.0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行分析。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=151.5X-2.596 6，r=0.999 9。結(jié)果表明馬尿酸在0.05～5.00 μg范圍內(nèi)其進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。將馬尿酸對(duì)照品進(jìn)行稀釋?zhuān)贸鲴R尿酸的最低檢測(cè)限為0.2 μg·mL-1(S/N=2)。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取50.0 μg·mL-1馬尿酸對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定馬尿酸峰面積，其RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取50.0 μg·mL-1的卡托普利溶液按“2.4”項(xiàng)的方法制備供試品溶液，4 ℃保存。在相同色譜條件下，分別于0，3，6，9，24 h進(jìn)樣測(cè)定馬尿酸峰面積，其RSD為1.04%，結(jié)果表明酶反應(yīng)后供試品溶液于4 ℃保存，24 h內(nèi)穩(wěn)定。

A.空白對(duì)照組；B.馬尿酸對(duì)照品；C.實(shí)驗(yàn)組；1.馬尿酸

圖1 ACE活性抑制反應(yīng)體系的高效液相色譜圖

A.blank control group；B.hippuric acid reference；C.test sample；1.hippuric acid

Fig.1 HPLC chromatograms of ACE inhibitory reaction system

2.9 卡托普利對(duì)ACE抑制作用的檢測(cè) 按“2.4”項(xiàng)下方法制備不同濃度卡托普利供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，對(duì)不同濃度的卡托普利供試品溶液(0.508×10-3，1.016×10-3，2.031×10-3，4.062×10-3，8.125×10-3，16.250×10-3，32.500×10-3，65.000×10-3μg·mL-1)進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算抑制率，其抑制曲線如圖2A所示。結(jié)果顯示隨著卡托普利濃度的不

斷提高，對(duì)ACE的抑制作用呈上升趨勢(shì)，最大抑制率達(dá)98%以上，經(jīng)SPSS 19.0版統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算其IC50值為2.344×10-3μg·mL-1。不同文獻(xiàn)報(bào)道卡托普利對(duì)ACE的活性抑制率有所不同，其IC50值范圍在0.163×10-3～47.802×10-3μg·mL-1[5]。按本實(shí)驗(yàn)方法所得到的卡托普利的IC50值也在此范圍內(nèi)，說(shuō)明本方法具有可行性。

2.10 霉茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素對(duì)ACE的抑制作用檢測(cè) 取5 830.000 μg·mL-1霉茶總黃酮母液加緩沖液制成 2 915.000，1 457.500，728.750，364.375，182.188，58.300，5.830，0.583，0.058，0.006 μg·mL-1的霉茶總黃酮樣品溶液。取4 167.000 μg·mL-1二氫楊梅素母液加緩沖液制成2 083.500，1 041.750，520.875，260.437，130.219，41.700，4.170，0.417，0.042，0.004 μg·mL-1二氫楊梅素樣品溶液；取420.000 μg·mL-1楊梅素母液加緩沖液稀釋制成210.000，105.000，52.500，26.250，13.125，4.200，0.420 μg·mL-1楊梅素樣品溶液。再按“2.4”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定各供試品中馬尿酸的峰面積，按照“2.2”項(xiàng)下方法計(jì)算抑制率。三者的抑制率曲線見(jiàn)圖2B，2C，2D。

從圖2中可以看出霉茶總黃酮和二氫楊梅素隨濃度的增加對(duì)ACE抑制作用亦增強(qiáng)，霉茶總黃酮對(duì)ACE的抑制率最高可達(dá)94%以上，經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算其IC50值為42.258 μg·mL-1；二氫楊梅素的抑制率可高達(dá)75%以上，其IC50值為30.879 μg·mL-1。說(shuō)明在高濃度下，霉茶總黃酮和二氫楊梅素對(duì)ACE具有較強(qiáng)的抑制作用；從總黃酮的IC50值與二氫楊梅素的IC50值可以推測(cè)霉茶總黃酮中主要抑制ACE活性的物質(zhì)可能為二氫楊梅素。楊梅素對(duì)ACE的抑制作用并不隨其濃度增加而增強(qiáng)，反而在20～70 μg·mL-1范圍內(nèi)對(duì)ACE具有促進(jìn)其活性的作用。

A.卡托普利；B.總黃酮；C.二氫楊梅素；D.楊梅素

3 討論

根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究及其他相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)霉茶總黃酮具有降壓作用[6-8]。在二腎一夾模型上觀察到，霉茶總黃酮可使血漿及心肌中血管緊張肽Ⅱ的水平降低[8]。筆者在本實(shí)驗(yàn)中利用高效液相色譜法測(cè)定ACEI對(duì)ACE活性的抑制作用，該方法具有簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[9]，可以用于霉茶總黃酮、二氫楊梅素和楊梅素對(duì)ACE抑制作用的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)霉茶總黃酮和二氫楊梅素對(duì)ACE具有較強(qiáng)的抑制作用。通過(guò)抑制ACE活性將使無(wú)活性的血管緊張肽Ⅰ不能轉(zhuǎn)化為血管緊張肽Ⅱ，使血管緊張肽Ⅱ生成減少，醛甾酮分泌降低，并可阻止緩激肽的降解而使其血管擴(kuò)張作用增強(qiáng)，刺激前列腺素I2及前列腺素E2的合成，從而使小動(dòng)脈舒張，周?chē)枇ο陆?，血壓降低[10]。上述結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明霉茶總黃酮具有降壓作用，二氫楊梅素可能為霉茶總黃酮中降壓的主要有效成分。

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Determination of Components from Ampelopsis Grossedentata by HPLC and Inhibitory Effect of Its on Angiotensin Converting Enzyme

WU Yong1,2, LUO Hong1, WANG Rui1,2, TAN Yongxia1,2, HU Junjie1,2, ZHANG Baohui1,2, TIAN Xianxiang1,2, ZHENG Guohua1,2, ZHANG Xiaoyi1

(1.SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430065,China； 2.KeyLaboratoryofChineseMedicineResourceandCompositus,MinistryofEducation,Wuhan430065,China)

Objective To measure the inhibition of components fromAmpelopsisgrossedentataon angiotensin converting enzyme (ACE) by high performance liquid chromatograph. Methods By quantitative determination of hippuric acid, the ACE-catalyzed product from the substrate HIPPURYL-HIS-LEU (HHL), the inhibitory effect of the total flavonoids ofAmpelopsisgrossedentata, dihydromyricetin and myricetin were evaluated respectively.High performance liquid chromatograph analysis was conducted on a Welchrom C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), eluting with water : acetonitrile (each containing 0.1% formic acid and 0.1% triethylamine)=78：22, at flow rate of 1.0 mL·min-1under temperature of 30 ℃, and the detection wavelength was set at 228 nm and the injection volume was 10 μL. Results The injection amount of hippuric acid showed good linearity with peak area within the range of 0.05-5.00 μg (r= 0.999 9), and the inhibitory rate of the total flavonoids ofAmpelopsisgrossedentataand dihydromyricetin reached more than 75% against ACE. Conclusion As the method exhibited, the total flavonoids ofAmpelopsisgrossedentataand dihydromyricetin have potent inhibition against ACE.For being simple, sensitive and repeatable, this method can be used for the screening of ACE inhibitorsinvitro.

Components fromAmpelopsisgrossedentata； Angiotensin converting enzyme；Inhibitory effect; Content determination; Chromatograph，high performance liquid

2014-12-11

2015-01-13

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173502)

吳勇(1973-)，男，湖北蘄春人，講師，博士，研究方向：中醫(yī)藥和天然藥物藥理。電話：027-68890101，E-mail：wuyong1991@163.com。

鄭國(guó)華(1964-)，男，天津人，博士生導(dǎo)師，博士，研究方向：中藥新制劑、新劑型的研究。電話：027-68890113，E-mail：zgh1227@sina.com。

R972.4；R965

A

1004-0781(2015)12-1559-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.003