微分干涉差顯微成像方法高通量分析單個(gè)蘇金云芽孢桿菌HD-1芽孢萌發(fā)

陳越彭立新王曉春黎永青劉軍賢王桂文（廣西師范大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,桂林54004）（廣西科學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室,南寧50007）（美國(guó)東卡羅來(lái)那大學(xué)物理系,美國(guó)北卡羅來(lái)那州格林維爾NC7858）

研究報(bào)告

微分干涉差顯微成像方法高通量分析單個(gè)蘇金云芽孢桿菌HD-1芽孢萌發(fā)

陳越1,2彭立新2王曉春2黎永青3劉軍賢*1王桂文*21（廣西師范大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,桂林541004）2（廣西科學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室,南寧530007）
3（美國(guó)東卡羅來(lái)那大學(xué)物理系,美國(guó)北卡羅來(lái)那州格林維爾NC27858）

蘇云金芽孢桿菌（Bt）休眠的芽孢具有極強(qiáng)的抗逆境能力,在合適的條件下很快萌發(fā)。本研究采用倒置顯微鏡建立微分干涉差（DIC）顯微成像方法,高通量實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大量單個(gè)HD-1芽孢的萌發(fā)過(guò)程,并運(yùn)用拉曼光譜進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示,萌發(fā)過(guò)程DIC圖像亮度變化動(dòng)態(tài)與芽孢吡啶二羧酸的含量變化有對(duì)應(yīng)性；6 s的時(shí)間分辨率即可較好地呈現(xiàn)芽孢的萌發(fā)動(dòng)態(tài)；以10mmol/L丙氨酸為營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑,Bt芽孢在Tris-HCl （pH 8.3）和Hepes（pH 7.4）緩沖液中的萌發(fā)動(dòng)態(tài)基本相同；Bt芽孢在非營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑月桂胺中萌發(fā)極其緩慢,而在外源2,6-吡啶二羧酸鈣下萌發(fā)極其迅速。結(jié)果表明,應(yīng)用DIC顯微成像技術(shù)可實(shí)現(xiàn)高通量實(shí)時(shí)觀測(cè)大量單個(gè)Bt芽孢萌發(fā)的動(dòng)態(tài)過(guò)程,為了解Bt芽孢的萌發(fā)機(jī)制和異質(zhì)性提供了極大便利。

蘇云金芽孢桿菌；微分干涉差顯微術(shù)；拉曼光譜；芽孢萌發(fā)；單細(xì)胞分析

1 引 言

芽孢是細(xì)菌的特殊休眠體,擁有獨(dú)特的成分和結(jié)構(gòu),具有極強(qiáng)的抗熱、抗輻射和抗化學(xué)藥物的能力[1,2]。遇到合適的條件,芽孢可以很快萌發(fā),恢復(fù)到生長(zhǎng)狀態(tài)。芽孢萌發(fā)并恢復(fù)新陳代謝特征是芽孢開(kāi)始營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的關(guān)鍵一步,一旦萌發(fā)就失去了原有的抗逆能力,更容易被殺死[2,3]。

對(duì)細(xì)菌芽孢萌發(fā)機(jī)理的研究多集中于對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）[4～6]。蘇金云芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前世界上生產(chǎn)規(guī)模最大、應(yīng)用最廣泛的生物農(nóng)藥[7,8]。雖然起主要作用的是伴隨芽孢形成而產(chǎn)生的伴孢晶體蛋白,但Bt芽孢可以單獨(dú)或通過(guò)晶體對(duì)昆蟲(chóng)起毒性作用[9],甚至有增強(qiáng)效應(yīng)[10]。早期對(duì)Bt芽孢萌發(fā)的研究集中在Bt芽孢在昆蟲(chóng)腸道內(nèi)的萌發(fā)規(guī)律[11,12],并陸續(xù)在萌發(fā)條件[13]和基因調(diào)控[14,15]等領(lǐng)域開(kāi)展研究。Bt既是廣泛應(yīng)用的生物農(nóng)藥,也是與炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）及蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）遺傳關(guān)系密切的物種。研究Bt芽孢萌發(fā)機(jī)制與萌發(fā)規(guī)律,可以更好地了解Bt農(nóng)藥制劑施用過(guò)程Bt芽孢在田間、昆蟲(chóng)腸道的存活規(guī)律,提高Bt制劑的殺蟲(chóng)效果,為Bt農(nóng)藥制劑生產(chǎn)服務(wù),加深對(duì)細(xì)菌芽孢萌發(fā)機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

對(duì)Bt芽孢萌發(fā)的研究多應(yīng)用常規(guī)的分光光度計(jì)檢測(cè)600 nm波長(zhǎng)處的光密度變化[13],僅得到反映群體芽孢平均萌發(fā)情況的萌發(fā)率,不能了解單個(gè)芽孢的萌發(fā)信息。文獻(xiàn)[16]應(yīng)用拉曼光譜觀測(cè)單個(gè)Bt芽孢的萌發(fā)過(guò)程,并發(fā)現(xiàn)其芽孢萌發(fā)存在異質(zhì)性,但是其分析效率較低。文獻(xiàn)[17]應(yīng)用微分干涉差（Differential interference contrast,DIC）顯微鏡或者相差顯微鏡成像等方法觀測(cè)枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的芽孢萌發(fā)過(guò)程,可以實(shí)時(shí)同步觀察大量芽胞的動(dòng)態(tài)萌發(fā),但尚未有應(yīng)用于Bt芽孢萌發(fā)研究的報(bào)道。

本研究將DIC顯微成像方法應(yīng)用于Bt芽孢,高通量監(jiān)測(cè)大量單個(gè)HD-1芽孢的萌發(fā)進(jìn)程,并通過(guò)拉曼光譜方法對(duì)萌發(fā)過(guò)程同步跟蹤。結(jié)果表明,單個(gè)芽孢萌發(fā)過(guò)程芽孢折光率的變化與孢內(nèi)大量的2,6-吡啶二羧酸（DPA）與Ca2+的絡(luò)合物CaDPA的釋放過(guò)程相對(duì)應(yīng),通過(guò)DIC強(qiáng)度的變化可以監(jiān)測(cè)Bt芽孢的萌發(fā)進(jìn)程,而且可以了解常規(guī)方法無(wú)法觀測(cè)的芽孢皮層水解的過(guò)程。DIC顯微成像技術(shù)可以高通量實(shí)時(shí)觀測(cè)大量單個(gè)Bt芽孢萌發(fā)動(dòng)態(tài),為了解Bt芽孢的萌發(fā)機(jī)制和異質(zhì)性提供了極大便利。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛋白胨和酵母提取物（英國(guó)Oxiod公司）,月桂胺和DPA（美國(guó)Sigma公司）,其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或者生物純?cè)噭?。蘇金云芽孢桿菌（B.thuringiensis）HD-1菌株（中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心）。

種子培養(yǎng)基（LB）：蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,pH 7.4～7.6。

液體培養(yǎng)基（CCY）：0.5mmol/LMgCl2·6H2O,0.01mmol/LMnCl2·4H2O,0.05mmol/L FeCl3· 6H2O,0.05mmol/L ZnCl2,0.2mmol/L CaCl2·6H2O,13mmol/L KH2PO4,26mmol/L K2HPO4,谷氨酰胺20 mg,酸水解干酪素1 g,酶水解干酪素1 g,酵母提取物0.4 g,甘油0.6 g,以去離子水定容至1000 mL。在121℃高溫滅菌20min。

萌發(fā)劑：10mmol/L丙氨酸,0.8mmol/L月桂胺,45mmol/L CaDPA。

緩沖液：25mmol/L（pH 7.4）Hepes緩沖液,25mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）。

2.2 芽孢制備

菌株在LB固體培養(yǎng)基活化24～36 h,挑取單菌落,轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基,200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)；按1％ 的比例轉(zhuǎn)入產(chǎn)孢培養(yǎng)基（CCY）,200 r/min培養(yǎng)48～60 h。鏡檢芽孢率達(dá)到99％后,5000 r/min離心收集、純化芽孢,無(wú)菌水洗滌10次,4℃避光保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)溫度均為30℃。

2.3 芽孢萌發(fā)

將待分析的Bt芽孢用無(wú)菌水稀釋為108個(gè)/mL,經(jīng)過(guò)70℃水浴30min、0℃冰浴15min的熱激處理后,吸取2μL滴加在蓋玻片上,真空干燥,將蓋玻片固定在自制的恒溫平臺(tái)上。參考芽胞萌發(fā)的常規(guī)條件[5,13],觀察營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑和非營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑誘發(fā)的Bt芽孢萌發(fā)過(guò)程。營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑是指可以作為細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的一類(lèi)萌發(fā)劑,非營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑則不能作為細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如鹽類(lèi)、表面活性劑等。（1）營(yíng)養(yǎng)萌發(fā) 加入預(yù)熱萌發(fā)劑（含10mmol/L丙氨酸的25mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸的（Hepes）緩沖液（pH 7.4）或者Tris-HCl緩沖液（pH 8.3））,培養(yǎng)溫度37℃；（2）非營(yíng)養(yǎng)萌發(fā) 待分析芽孢不經(jīng)過(guò)熱激處理,順序加入45mmol/L CaDPA或者0.8mmol/L月桂胺和25mmol/L Hepes緩沖液（pH 7.4）,培養(yǎng)溫度分別為30℃和45℃。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,每1 s、6 s或12 s采集一幅DIC圖像,45mmol/LCaDPA的萌發(fā)過(guò)程觀察50min,其它實(shí)驗(yàn)持續(xù)觀察2 h。

2.4 顯微拉曼光譜收集

應(yīng)用單細(xì)胞激光拉曼光譜系統(tǒng)[18,19]聚焦在單個(gè)芽孢上采集拉曼光譜。激光強(qiáng)度為5 mW,從加入萌發(fā)劑開(kāi)始連續(xù)采集拉曼光譜,每個(gè)光譜的積分時(shí)間為15 s,直到芽胞萌發(fā)后30～50min。

2.5 微分干涉差顯微成像測(cè)定

微分干涉差顯微術(shù)是以平面偏振光為光源,光線經(jīng)過(guò)棱鏡折射后分成兩束,當(dāng)光通過(guò)細(xì)胞時(shí),光的相位發(fā)生變化,通過(guò)細(xì)胞厚而精密的部位（如核）時(shí)光速變慢,與通過(guò)鄰近薄的部位（如胞質(zhì)）的光之間產(chǎn)生相位偏移,當(dāng)兩束光線再聯(lián)合起來(lái)時(shí)產(chǎn)生干涉效應(yīng),顯示活細(xì)胞的細(xì)節(jié)。芽孢的核心是一個(gè)CaDPA的巨型倉(cāng)庫(kù),并且水的含量非常少,折射率高,DIC顯微鏡將其轉(zhuǎn)換成一個(gè)振幅圖像,可通過(guò)CCD將其記錄下來(lái)。在萌發(fā)過(guò)程中,芽孢內(nèi)部物質(zhì)（其中主要的大分子為CaDPA）大量的釋放并與周?chē)肿舆M(jìn)行置換,折射率發(fā)生變化[20]。

將DIC顯微鏡（Olympus IX81,日本Olympus公司）稍加改造,并接入高性能CCD（CoolSNAP cf2,美國(guó)Photometrics公司）,實(shí)現(xiàn)同步監(jiān)測(cè)芽孢萌發(fā)過(guò)程的拉曼光譜和DIC圖像（圖1）。通過(guò)自編VC程序,每隔一定的時(shí)間自動(dòng)采集一幅DIC圖像,圖像采集過(guò)程通過(guò)顯微鏡自帶的穩(wěn)焦模塊保持圖像始終處于同一焦平面上。圖像處理：基于芽孢的相襯圖像的強(qiáng)度比背景高（圖2D）,用Matlab軟件編寫(xiě)程序,設(shè)置強(qiáng)度閾值將圖像轉(zhuǎn)換成二進(jìn)制的黑白圖像；以單個(gè)芽孢為中心,計(jì)算芽孢范圍內(nèi)20個(gè)像素位點(diǎn)白色區(qū)域的平均強(qiáng)度,作為芽孢圖像信號(hào)積分,依時(shí)間函數(shù)繪制成芽孢萌發(fā)過(guò)程的實(shí)時(shí)DIC信號(hào)強(qiáng)度變化曲線（圖2）。

圖1 實(shí)驗(yàn)中所用微分干涉差顯微成像系統(tǒng)和拉曼光譜系統(tǒng)示意圖Fig.1 Setup schematic of differential interference contrast（DIC）microscopy imaging system and Raman spectroscopy system used in this work.

圖2 單個(gè)芽孢與伴孢晶體蛋白的拉曼光譜（A）；DIC顯微成像技術(shù)（B）與實(shí)時(shí)拉曼光譜（C）同步分析a,b,c 3個(gè)Bt芽孢萌發(fā)的動(dòng)態(tài)過(guò)程；D是圖B和圖C中a,b兩個(gè)芽孢的DIC圖像變化過(guò)程。Fig.2 Raman spectra of single spore and crystal protein from B.thuringiensis（Bt）（A）.Simultaneous monitoring of the germination of three individual Bt spores by DICmicroscopy imaging（B）and Raman spectroscopy（C）.（D）,DIC images of germination process of spore a and b showing in Fig.B and C

3 結(jié)果與分析

3.1 DIC與拉曼光譜同步監(jiān)測(cè)單個(gè)芽孢萌發(fā)

芽孢萌發(fā)過(guò)程中經(jīng)歷3個(gè)明顯階段：萌發(fā)遲滯期、孢內(nèi)CaDPA釋放階段和肽聚糖皮層溶解階段[5]。圖2是應(yīng)用DIC顯微成像和共焦顯微拉曼實(shí)時(shí)同步分析同一Bt芽孢的萌發(fā)動(dòng)態(tài)過(guò)程。伴隨著芽孢的形成,生成的伴孢晶體蛋白是Bt生物農(nóng)藥的關(guān)鍵成分,大小與芽孢類(lèi)似,但顯示出顯著不同的拉曼光譜特征峰（圖2A）,其中1017 cm-1是芽孢CaDPA的特有峰,其峰面積可定量芽孢的CaDPA總量[16]。圖2B是芽孢萌發(fā)過(guò)程DIC圖像亮度變化動(dòng)態(tài),設(shè)定芽孢與萌發(fā)劑開(kāi)始接觸的時(shí)間為0,孢內(nèi)CaDPA開(kāi)始快速釋放的時(shí)間為遲滯時(shí)間tlag,孢內(nèi)CaDPA釋放完畢的時(shí)間為trelease,芽孢皮層完全溶解的時(shí)間為tlys,定義CaDPA釋放需要的時(shí)間為Δtrelease=trelease-tlag,皮層溶解所需時(shí)間為Δtlys=tlys-trelease。圖2D顯示對(duì)應(yīng)的芽孢圖像,每個(gè)芽孢被小的暗條分成兩個(gè)亮的部分,這是由于芽孢中心相位梯度形成,DIC圖像越亮,CaDPA的含量越高。

為了確認(rèn)芽孢萌發(fā)過(guò)程DIC圖像亮度與孢內(nèi)CaDPA釋放的對(duì)應(yīng)關(guān)系,通過(guò)顯微拉曼光譜同時(shí)記錄同一芽孢的DIC圖像和拉曼光譜,計(jì)算芽孢的CaDPA特征峰1017 cm-1的峰高,畫(huà)出其變化曲線（圖2C）。在CaDPA開(kāi)始大量釋放前（tlag）,芽孢的DIC圖像亮度和1017 cm-1峰已經(jīng)逐漸降低；tlag后, DIC圖像亮度和1017 cm-1峰強(qiáng)度都快速降低,直到孢內(nèi)CaDPA完全釋放（trelease）,1017 cm-1峰完全消失；之后DIC圖像亮度隨著芽孢皮層溶解緩慢下降,并逐漸保持基本不變。因此,在Bt芽孢萌發(fā)過(guò)程中,孢內(nèi)CaDPA釋放過(guò)程（即trelease時(shí)間點(diǎn)前）DIC圖像亮度與CaDPA的含量變化高度一致,可以通過(guò)DIC強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)Bt芽孢的萌發(fā)進(jìn)程,而且可以獲知常規(guī)方法無(wú)法獲知的芽孢皮層水解的過(guò)程。

3.2 單個(gè)Bt芽孢萌發(fā)細(xì)節(jié)

對(duì)比了DIC成像在1,2,6,9和12 s等不同的時(shí)間分辨率下監(jiān)測(cè)同一單個(gè)Bt芽孢的萌發(fā)動(dòng)態(tài), 圖3中是2,6和12 s的動(dòng)態(tài)曲線,每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)圖像采集時(shí)間點(diǎn)。2,6和12 s的分辨率均可以顯示整個(gè)芽胞萌發(fā)動(dòng)態(tài),2 s的時(shí)間間隔非常短暫,記錄的點(diǎn)非常緊湊,有時(shí)不能很好地判斷萌發(fā)各階段的準(zhǔn)確時(shí)間點(diǎn),且記錄的數(shù)據(jù)量很大；而12 s的時(shí)間分辨率的時(shí)間間隔略大,芽孢肽聚糖皮層溶解過(guò)程的萌發(fā)細(xì)節(jié)不明顯,容易被忽略；6 s的時(shí)間分辨率可清晰地展示每個(gè)階段的萌發(fā)細(xì)節(jié)。表1統(tǒng)計(jì)了30個(gè)芽孢在不同時(shí)間分辨率下的萌發(fā)參數(shù),t-測(cè)驗(yàn)顯示無(wú)顯著差異。對(duì)比不同時(shí)間分辨率下的萌發(fā)曲線,結(jié)合萌發(fā)參數(shù)統(tǒng)計(jì),時(shí)間分辨率6 s即可準(zhǔn)確定位CaDPA的快速釋放過(guò)程,適合觀察芽孢萌發(fā)動(dòng)態(tài)細(xì)節(jié)。

表1 Bt芽孢不同時(shí)間間隔下得到的萌發(fā)參數(shù)*Table 1 Germination parameters of B.thuringiensis spores recorded at different time intervals

3.3 高通量實(shí)時(shí)分析大量單個(gè)Bt芽孢萌發(fā)

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,應(yīng)用DIC成像實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了大量Bt芽孢在不同的萌發(fā)劑和萌發(fā)條件下的萌發(fā)過(guò)程。在顯微鏡同一視野下同時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄300～700個(gè)芽孢的萌發(fā)過(guò)程,監(jiān)測(cè)時(shí)間為120min。每隔5～10min統(tǒng)計(jì)一次已經(jīng)萌發(fā)的芽孢數(shù),得到的群體曲線見(jiàn)圖4A。在10mmol/L營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑丙氨酸激發(fā)下,Bt芽孢在Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）和Hepes緩沖液（pH 8.3）中的群體萌發(fā)過(guò)程基本相同,加入萌發(fā)劑后,芽孢就陸續(xù)開(kāi)始萌發(fā),多數(shù)芽胞在20min內(nèi)萌發(fā),而95％以上的芽孢在60min內(nèi)萌發(fā),但仍然約有1％的孢子在120min的觀察期內(nèi)未萌發(fā)；而在45mmol/L非營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑CaDPA下,芽孢萌發(fā)極快,95％以上的芽孢在10min內(nèi)萌發(fā),約有0.2％孢子在120min的觀察期內(nèi)未萌發(fā)；同樣是非營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑,Bt芽孢經(jīng)月桂胺誘發(fā),在120min的觀察期內(nèi)僅有約4％芽孢萌發(fā)。原因可能是兩者所誘發(fā)的芽胞萌發(fā)機(jī)制不同,外源CaDPA通過(guò)激活皮層水解酶CwlJ水解位于芽孢皮層的肽聚糖,進(jìn)而引起孢內(nèi)CaDPA的釋放[3],而月桂胺則可能是直接或間接打開(kāi)釋放CaDPA的通道[21]。

圖3 同一Bt芽孢不同時(shí)間間隔（2 s,6 s,12 s）的萌發(fā)過(guò)程動(dòng)態(tài)曲線Fig.3 Germination dynamics of single B.thuringiensis spore recorded in the time intervals of2 s,6 s and 12 s

圖4（B～D）是隨機(jī)選擇的6個(gè)單個(gè)芽孢的萌發(fā)動(dòng)態(tài),將其DIC初始強(qiáng)度歸一為1,萌發(fā)后DIC強(qiáng)度的最低值,歸一為0。由圖4可見(jiàn)：（1）在同樣的萌發(fā)條件下,芽孢萌發(fā)的動(dòng)態(tài)過(guò)程是類(lèi)似的,顯著不同的是芽孢DIC強(qiáng)度快速降低的開(kāi)始時(shí)間（即孢內(nèi)CaDPA開(kāi)始快速釋放的時(shí)間,tlag）；（2）在tlag時(shí)間點(diǎn)前,芽孢的亮度變化很小,約下降5％ ～10％,說(shuō)明在tlag前,孢內(nèi)CaDPA僅有少量釋放；（3）tlag時(shí)間點(diǎn)后,芽孢的亮度快速下降,到trelease（CaDPA快速釋放階段結(jié)束,圖2）時(shí),芽孢的亮度約為初始的70％～80％；（4）trelease后,芽胞圖像亮度降低約5％ ～10％,這是芽胞皮層水解的過(guò)程。

隨機(jī)選擇約 50個(gè)芽孢,統(tǒng)計(jì) tlag,trelease,tlys, Δtrelease和 Δtlys等萌發(fā)參數(shù)。 由表 2可知,（1）在10mmol/L丙氨酸觸發(fā)下,Bt芽孢在Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）和Hepes緩沖液（pH 8.3））下的萌發(fā)參數(shù)基本相同；（2）與圖4B和4C顯示的萌發(fā)動(dòng)態(tài)過(guò)程類(lèi)似,在同樣的萌發(fā)條件下,芽孢快速釋放孢內(nèi)DPA的過(guò)程基本相同,Δtrelease值為1.0～1.6min,其標(biāo)準(zhǔn)差（SD值）約為0.6min；（3）在同樣的萌發(fā)條件下,芽孢萌發(fā)的異質(zhì)性表現(xiàn)在tlag值顯著不同,在10mmol/L丙氨酸激發(fā)下,其SD值約為10min；相應(yīng)地,受tlag值的異質(zhì)性影響,芽胞萌發(fā)的trelease,tlys值也差異顯著；（4）在外源CaDPA的觸發(fā)下,芽孢皮層溶解的過(guò)程（即Δtlys）比丙氨酸觸發(fā)快。

上述結(jié)果表明,采用單個(gè)視野的DIC成像方法可以同時(shí)觀察300～700個(gè)芽胞的萌發(fā)過(guò)程。如果采用自動(dòng)轉(zhuǎn)換平臺(tái),每6 s采集一幀圖像,考慮視野轉(zhuǎn)換和曝光所需的時(shí)間,在6 s時(shí)間內(nèi)可以循環(huán)采集4個(gè)視野的圖像,則在同一次實(shí)驗(yàn)中可以觀察多達(dá)2800個(gè)以上的芽胞萌發(fā)過(guò)程。

表2 Bt HD-1芽孢在不同的萌發(fā)劑、不同緩沖液下的萌發(fā)參數(shù)*Table 2 Germination parameters of B.thuringiensis HD-1 spores（n=50）

4 結(jié)論

通過(guò)改造微分干涉差（DIC）顯微鏡,接入高性能CCD,用顯微鏡自帶的穩(wěn)焦模塊保持圖像始終處于同一焦平面上,通過(guò)自編程序,每隔一定的時(shí)間自動(dòng)采集一幅DIC圖像,觀察了Bt芽孢的動(dòng)態(tài)萌發(fā)過(guò)程。經(jīng)與拉曼光譜同步監(jiān)測(cè),孢子釋放CaDPA的過(guò)程與DIC圖像強(qiáng)度變化一致；應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)同步觀察了大量Bt芽孢在營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑和非營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑下的萌發(fā)動(dòng)態(tài)發(fā)現(xiàn),Bt芽孢在Tris-HCl（pH 8.3）緩沖液和Hepes（pH 7.4）緩沖液中的萌發(fā)情況基本相同,而在非營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)劑月桂胺中萌發(fā)非常緩慢,在外源CaDPA下卻很迅速。在相同的萌發(fā)條件下,同一群體內(nèi)Bt芽孢間的萌發(fā)異質(zhì)性主要體現(xiàn)在參數(shù)tlag上。研究結(jié)果表明,通過(guò)DIC顯微鏡可以高通量分析單個(gè)Bt芽孢萌發(fā)的動(dòng)態(tài)過(guò)程,闡明其萌發(fā)特征,為了解Bt芽孢的萌發(fā)機(jī)制和異質(zhì)性提供了極大便利。

圖4 A,Bt HD-1芽孢在不同萌發(fā)條件下的萌發(fā)曲線；B～D,不同萌發(fā)劑條件下6個(gè)芽胞各自萌發(fā)的動(dòng)態(tài)過(guò)程：B,10mmol/L丙氨酸,25mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）；C,10mmol/L丙氨酸,25mmol/L Hepes （pH 7.4）；D,45mmol/L CaDPA。Fig.4 （A）Germination of B.thuringiensis HD-1 spores and（B-D）kinetics of germination of 6 individual spores.Spores were germinated in 25mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）（B）or in 25mmol/L Hepes buffer （pH 7.4）（C）with 10mmol/L alanine,or with 45mmol/L calcinm dicarboxylic acid（CaDPA）（D）

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《國(guó)網(wǎng)通用設(shè)計(jì)》因篇幅受限，裝配式建筑墻體只推薦了形式，沒(méi)有詳圖設(shè)計(jì)。陜西西安某110 kV變電站，采用《國(guó)網(wǎng)通用設(shè)計(jì)》中全戶內(nèi)變電站110-A2-3方案[3](應(yīng)用本文時(shí)應(yīng)以《國(guó)網(wǎng)通用設(shè)計(jì)》中該方案的適用條件為準(zhǔn))。該變電站為城市型全戶內(nèi)變電站，《國(guó)網(wǎng)通用設(shè)計(jì)》統(tǒng)一了配電裝置樓的墻體材料：外墻采用壓型鋼板復(fù)合板，內(nèi)墻采用輕鋼龍骨石膏板隔墻。在該工程設(shè)計(jì)時(shí)，根據(jù)規(guī)程規(guī)范的防火、節(jié)能、降噪等要求，分別對(duì)變電站的內(nèi)隔墻、外墻，進(jìn)行墻體參數(shù)細(xì)化設(shè)計(jì)研究，內(nèi)墻主要根據(jù)墻體材料耐火極限進(jìn)行設(shè)計(jì)，外墻根據(jù)防火、節(jié)能、降噪等要求進(jìn)行設(shè)計(jì)計(jì)算。

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（Received 27 April 2015；accepted 10 August2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.11264004,31460035）

High-throughput Investigation of Germ ination of Individual Bacillus Thuringiensis HD-1 Spores by Differential Interference Contrast M icroscopy Imaging

CHEN Yue1,2,PENG Li-Xin2,WANG Xiao-Chun2,LIYong-Qing3,LIU Jun-Xian*1,WANG Gui-Wen*21（College of Physics Sciences＆Technology,Guangxi Normal University,Guilin 541004,China）
2（Laboratory of Biophysics,Guangxi Academy ofSciences,Nanning 530007,China）
3（Department of Physics,East Carolina University,Greenville,NC 27858,USA）

Bacillus thuringiensis（Bt）,a unique bacterium which forms parasporal crystal protein and spore in parallel,is themostwidely used environmentally in compatible biopesticide worldwide.Bt spore has a strong resistance to stress and adversity,and germinates rapidly once conditions are favorable for growth.In this work,differential interference contrast（DIC）microscopy was used tomonitor the germination of individual Bt HD-1 spores,and the germination process was also investigated with Raman spectroscopy simultaneously.Experiment results showed that the decrease in normalized DIC intensity of Bt spore was consistent with the release of pyridine-2,6-pyridine dicarboxylic acid（dipicolinic acid[DPA]） determined by Raman spectroscopy.Temporal resolution of 6 seconds could well describe the dynamic process of spore germination.Bt spore showed similar germination kinetics triggered either by 10mmol/L alanine at 37℃ in 25mmol/L Tris-HCl buffer（pH 8.3）or in 25mmol/L Hepes buffer（pH 7.4）.Most spores did not germinate triggered by dodecylamine but germinated rapidly triggered by exogenous Ca-DPA.These results indicated that DIC microscopy imaging could be used to observe germination of individual Bt spores in real-time quantitatively, and help to the understanding ofmechanisms of Bt spore germination and its heterogeneity.

Bacillus thuringiensis；Differential interference contrastmicroscopy；Raman spectroscopy；Spore germination；Single-cell analysis

10.11895/j.issn.0253-3820.100345

2015-04-27收稿；2015-08-10接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Nos.11264004,31460035）資助

E-mail：jxliu@mailbox.gxnu.edu.cn；wguiwen@gxas.cn