長柄扁桃仁多酚提取工藝及抗氧化活性研究

蘇 銳，樊金拴，鄭 濤，趙韻美，馬 菁，高智輝

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵712100）

長柄扁桃（Amygdalus pedunculata），又叫野櫻桃、柄扁桃、苦豆子、山櫻桃、布衣勒斯，屬多年生木本植物，落葉灌木。長柄扁桃主要分布于內(nèi)蒙古陰山淺山區(qū)和陜北神木、定邊、橫山、榆林等地，在榆林有集中分布［1］。長柄扁桃具有抗旱、固沙、抗風(fēng)蝕、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)良特性，是我國西部干旱、半干旱地區(qū)山地和沙地良好的水土保持樹種、觀賞灌木，是育種的原始材料及嫁接繁殖普通扁桃的砧木［1-2］。長柄扁桃的果仁出油率高，用壓榨法提取，最高出油率可達(dá)46%。其中的棕櫚油酸有益于皮膚保健、預(yù)防治療高血壓、心血管系統(tǒng)疾病，微量元素對人的身體健康也大有裨益。以長柄扁桃油為原料，可成功制備生物柴油，轉(zhuǎn)化率可達(dá)98%以上，產(chǎn)油率在9%以上［3］。長柄扁桃仁中苦杏仁甙含量約為0.2%?？嘈尤蔬笆侵匾尼t(yī)藥原材料，具有降氣、止咳、平喘、潤腸和通便的功效［4］。

植物多酚（plant polyphenol）是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的多酚類物質(zhì)，在植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，儲量豐富［5］。酚類物質(zhì)對人體有著重要的生理功能，具有很強(qiáng)的抗氧化效果［6］。目前，國內(nèi)外對于多酚類物質(zhì)的研究主要集中在蘋果、核桃、板栗、茶樹等方面［7-11］，對長柄扁桃的研究主要集中在葉片結(jié)構(gòu)、生理生化特性、種仁油料提取、仁中礦質(zhì)元素分析等方面［12-16］，而對長柄扁桃仁中多酚物質(zhì)的含量及其抗氧化活性等報道較少。本研究以多酚提取量為指標(biāo)，通過單因素及正交試驗對長柄扁桃仁中多酚的提取工藝進(jìn)行研究，并且利用DPPH法、ABTS法及FRAP法測定了陜西神木、榆陽、內(nèi)蒙古烏審旗、固陽、河北豐寧5個不同種源地樣品清除自由基的能力及總還原力，旨在開發(fā)高附加值的長柄扁桃仁多酚，為長柄扁桃的綜合利用和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

長柄扁桃種子→脫殼→粉碎→超聲處理→抽濾→測定多酚提取量→測定抗氧化活性

1.1 材料與試劑

長柄扁桃種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院郭春會教授提供（分別采自陜西榆陽、陜西神木、內(nèi)蒙古烏審旗、內(nèi)蒙古固陽、河北豐寧）。

二苯基苦味酰基苯肼基自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-聯(lián) 氮-雙-（3-乙 基 苯噻唑啉-6-磺酸）［（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfpnic acid），ABTS］、三 吡 啶 三 吖 嗪（tripyridyl-triazine，TPTZ）美國sigma公司；福林酚 北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸 上海晶純生化科技股份有限公司；無水碳酸鈉 廣東光華化學(xué)廠有限公司；石油醚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、濃鹽酸、過硫酸鉀、醋酸鈉、三氯化鐵 天津博迪化工股份有限公司；無水乙醇、氯化鈉、氯化鉀、冰乙酸 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3100紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；XMTD電熱恒溫水浴鍋 北京科偉試驗儀器設(shè)備廠；FA2004分析天平 上海精科天平；KQ-500DE超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；H1650臺式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FW-200高速萬能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 材料處理

將5個種源地的長柄扁桃種子進(jìn)行破殼，把種仁粉碎成粉末按照料液比1g∶21mL加入石油醚（沸程60～90℃），在50℃350W 下進(jìn)行超聲處理30min。抽濾得去油脂后的樣品粉末（提取率約為66.0%），置于-4℃冰箱保存［17-19］。

1.4 長柄扁桃仁多酚的提取

1.4.1 單因素試驗 以陜西省榆林市榆陽區(qū)采得種子為材料，采用超聲輔助提取法［20-22］，研究料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時間、提取溫度對長柄扁桃仁中多酚提取量的影響，試驗重復(fù)5次，取平均值。

1.4.1.1 料液比 準(zhǔn)確稱取0.5g脫脂后的仁粉，按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g∶mL）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，在30℃350W功率下超聲提取30min，抽濾得提取液，定容至50mL，得10mg·mL-1提取液。以多酚提取量為考察指標(biāo)確定最佳料液比。

1.4.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 準(zhǔn)確稱取0.5g脫脂后的仁粉，加入15mL體積分?jǐn)?shù)分別為0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，在30℃350W功率下超聲提取30min，抽濾得提取液，定容至50mL，得10mg·mL-1提取液。以多酚提取量為考察指標(biāo)確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.4.1.3 時間 準(zhǔn)確稱取0.5g脫脂后的仁粉，加入15mL體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇，在30℃350W功率下分別超聲提取15、30、45、60、75min和90min，抽濾得提取液，定容至50mL，得10mg·mL-1提取液。以多酚提取量為考察指標(biāo)確定最佳提取時間。

1.4.1.4 溫度 準(zhǔn)確稱取0.5g脫脂后的仁粉，加入15mL體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇，分別在30、40、50、60℃和70℃350W功率下超聲提取60min，抽濾得提取液，定容至50mL，得10mg·mL-1提取液。以多酚提取量為考察指標(biāo)確定最佳提取溫度。

1.4.2 正交試驗 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對長柄扁桃仁多酚提取工藝的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和時間進(jìn)行4因素3水平的L9（34）正交試驗（表1），確定最佳提取條件組合，試驗重復(fù)3次。

1.5 長柄扁桃仁多酚提取量的測定

采用福林酚法［23-24］進(jìn)行多酚提取量測定。將沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確稱取25mg沒食子酸，加蒸餾水定容至1 000mL，制得0.025mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液。分別準(zhǔn)確稱取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL和5.0mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液加入0.5mL Folin-Ciocalteau顯色劑，反應(yīng)20 min后加入2.5mL 1mol·L-1Na2CO3溶液定容至25mL。在30℃下避光水浴1h后離心，測定765nm處的吸光值。以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，測得吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.104 9x+0.020 2，R2=0.996 5。

表1 正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal experiment

取1mL提取液按照上述方法顯色，測定765 nm處的吸光值。依據(jù)線性回歸方程，計算可得提取液中多酚提取量m（沒食子酸當(dāng)量）。

式中：m為1mL提取液中所含多酚質(zhì)量（mg），M為長柄扁桃仁脫脂后質(zhì)量（g），N為提取液的稀釋倍數(shù)。

1.6 抗氧化活性測定

1.6.1 DPPH自由基清除能力測定 參照Yen［25，27-28］等方法，有改動。分別取最佳工藝下神木、榆陽、烏審旗、固陽、豐寧5個種源地的長柄扁桃仁多酚提取液5mL定容至25mL，依次稀釋得2 000、1 500、1 200、1 000、900、800、600、400、200、100、50μg·mL-1和25μg·mL-1樣品。分別吸取2mL樣液、2mL 0.1mmol·L-1DPPH 溶液混勻，避光靜置30min后，在517nm測得試樣吸光值（Ai），取2mL 20%乙醇代替樣液測得空白吸光值（Ac），以2mL樣液中加入2mL 20%乙醇測得樣液吸光值（Aj），按下列公式計算清除率K（%）。

以稀釋后的質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，清除率K（%）為縱坐標(biāo)繪制對數(shù)曲線，計算清除率50%時樣品的濃度（IC50），試驗重復(fù)3次。

1.6.2 ABTS自由基清除能力測定 參照Re R［26-30］等方法，有改動。

ABTS·+反應(yīng)液配制：將7mmol·L-1ABTS溶液與2.45mmol·L-1K2S2O8溶液按1∶1混合，室溫反應(yīng)過夜（12～16h）制成ABTS·+儲備液。使用前用10mmol·L-1的PBS緩沖液稀釋，調(diào)節(jié)其在30℃，734nm下的吸光值為0.70±0.02，制得成ABTS·+反應(yīng)液。

以Vc為標(biāo)準(zhǔn)品計算抗氧化活性（VCEAC值，單位μmol·g-1）。稱取0.017 6g抗壞血酸，蒸餾水溶解定容至100mL，得到1mmol·L-1的Vc標(biāo)準(zhǔn)液。依次取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0mL 和5.0 mL Vc標(biāo)準(zhǔn)液于10mL容量瓶中，蒸餾水定容，得到0.0、0.1、0.2、0.3、0.4mmol·L-1和0.5mmol·L-1濃度梯度的Vc標(biāo)準(zhǔn)液。

式中：A0為Vc濃度為0.0mmol·L-1時測得的吸光值。

取0.1mL不同濃度梯度的Vc標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，加入3.9mL ABTS·+工作液混勻，37℃水浴10min，測定734nm處的吸光值A(chǔ)734，計算清除率K（%）。以Vc濃度（μmol·L-1）為橫坐標(biāo)，清除率K（%）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=92.104x+0.200 7，R2=0.999 7。將最佳工藝下5個不同種源地的長柄扁桃仁多酚提取液稀釋至6 mg·mL-1，進(jìn)行以上操作，測得清除率計算VCEAC 值（μmol·g-1），試驗重復(fù)3次。

1.6.3 FRAP法測定總還原力 參照Benzie和Strain［31-32］等方法，有改動。

FRAP工作液配制：300mmol·L-1醋酸鹽緩沖液、10mmol·L-1TPTZ溶液、20mmol·L-1三氯化鐵溶液按10∶1∶1配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

準(zhǔn)確稱取0.030 4g硫酸亞鐵溶于適量的水中，加入18mo1·L-1的硫酸2.5mL，加蒸餾水定容至100mL。取上述溶液5mL于50mL容量瓶中，蒸餾水定容，即為2 000μmol·L-1FeSO4溶液。稀釋依次配得0、25、50、75、100、125、150、175 μmol·L-1和200μmol·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取0.4mL不同濃度梯度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入3mL FRAP工作液，37℃下反應(yīng)10min，測定593nm處的吸光值A(chǔ)593。以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μmol·L-1）為橫坐標(biāo)，測得吸光值A(chǔ)593為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.002 6x+0.161 2，R2=0.993 6。將最佳提取工藝下5個不同種源地的長柄扁桃仁多酚提取液稀釋至1mg·mL-1，進(jìn)行以上操作，計算FRAP值，試驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對多酚提取的影響

由圖1可知，隨著乙醇使用量的增加，多酚提取量呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)料液比1g∶10mL時，多酚提取量為（1.279±0.043）mg·g-1，料液比1g∶20mL時多酚提取量為（1.378±0.046）mg·g-1，顯著高于其他各料液比（p＜0.05），之后呈下降趨勢。這可能是因為料液比為1∶20時，溶劑對多酚的溶解已基本達(dá)到飽和，繼續(xù)增加溶劑用量，并不能顯著提高多酚提取量。

圖1 不同料液比對多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ratio of material to solvent on the polyphenols extraction

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，多酚提取量呈先下降后上升再下降的趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為0%，即使用水提取時，多酚提取量為（1.927±0.163）mg·g-1，當(dāng)使用10%乙醇提取時，多酚提取量下降至（1.771±0.095）mg·g-1，當(dāng)使用20%乙醇提取時，多酚提取量最高為（1.980±0.119）mg·g-1，顯著高于使用30%乙醇時的多酚提取量（p＜0.05），之后多酚提取量呈下降趨勢。這可能是因為當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，其他物質(zhì)如醇溶性雜質(zhì)等成分溶出量增加，這些物質(zhì)與多酚競爭乙醇-水分子，使得多酚溶出量降低，進(jìn)而導(dǎo)致多酚得率下降。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)以20%為最佳［33］。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取的影響Fig.2 Effect of concentration on the polyphenols extraction

2.3 超聲時間對多酚提取的影響

由圖3可知，當(dāng)提取時間介于15～60min時，長柄扁桃仁多酚提取量隨著提取時間的增加而增加，60min時含量達(dá)到最高，為（2.032±0.065）mg·g-1，顯著高于15～45min時的提取量（p＜0.05）。而當(dāng)提取時間超過60min時，多酚提取量隨著提取時間的增加而略有降低。這可能是由于浸提時間太短，與蛋白質(zhì)、纖維素結(jié)合的酚類物質(zhì)來不及溶出；提取時間過長，由于多酚類物質(zhì)穩(wěn)定性不好，容易發(fā)生分解［34］，所以提取時間過長，其含量降低。因此，提取時間以60min為最佳。

圖3 不同超聲時間對多酚提取的影響Fig.3 Effect of time on the polyphenols extraction

2.4 提取溫度對多酚提取的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，多酚提取量呈下降趨勢。當(dāng)在30℃下提取時，多酚提取量為（2.067±0.131）mg·g-1，顯著高于其他各溫度梯度（p＜0.05），在50℃下提取時，多酚提取量為（1.720±0.024）mg·g-1，當(dāng)提取溫度為70℃時，多酚提取量僅為（0.503±0.110）mg·g-1。

圖4 不同提取溫度對多酚提取的影響Fig.4 Effect of temperature on the polyphenols extraction

一般來說，溫度越高，擴(kuò)散速度越快。因為溫度升高，使得植物組織軟化快，易膨脹，從而增加可溶性物質(zhì)的溶解度和擴(kuò)散速度，促進(jìn)有效成分浸出。但溫度過高，酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)易受到破壞，導(dǎo)致多酚提取量降低。因此，提取溫度以30℃為佳。

2.5 長柄扁桃仁多酚提取的正交試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對長柄扁桃仁多酚提取工藝中的料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和時間4個因素按照L9（34）正交表進(jìn)行試驗，結(jié)果如表2、表3所示。

由表2可以看出，長柄扁桃仁中多酚的最佳提取工藝為處理二，即乙醇體積分?jǐn)?shù)20%，料液比1∶20，提取溫度40℃，提取60min。通過方差分析（表3）可以看出，超聲時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)有極顯著差異（p＜0.01），溫度和料液比有顯著差異（p＜0.05）。各因素對多酚提取量影響大小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞溫度＞時間，說明在選取的各因素梯度范圍內(nèi)，超聲輔助提取多酚對乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比非常敏感，對溫度、時間較敏感。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

2.6 最佳工藝驗證試驗

準(zhǔn)確稱取0.5g脫脂后的仁粉，按照上述最佳工藝條件提取，計算多酚提取量。表4表明，最佳條件下多酚的平均提取量是2.102mg·g-1，重復(fù)性好，按此條件提取的多酚提取量均高于表2中的任何一組。因此在本試驗范圍內(nèi)處理2為最佳提取工藝參數(shù)。

表4 驗證試驗結(jié)果Table 4 Results of validation experiment

2.7 不同種源地種仁的抗氧化活性比較

由圖5、表5可知，不同種源地的長柄扁桃仁多酚提取液均有不同的清除自由基能力。其中神木樣品的IC50值和VCEAC值分別為（199.90±14.07）μg·mL-1和（139.65±1.43）μmol·g-1，清除自由基能力顯著強(qiáng)于另外4個種源地樣品（p＜0.05），榆陽、烏審旗樣品次之，IC50值和VCEAC值分別為（388.66±9.36）μg·mL-1、（127.78±3.30）μmol·g-1和（394.31±8.96）μg·mL-1、（132.43±1.78）μmol·g-1，豐寧樣品IC50值和VCEAC 值僅分別為（640.87±24.45）μg·mL-1和（55.68±3.52）μmol·g-1。

圖5 不同種源地樣品DPPH清除率比較Fig.5 DPPH scavenging effect of the samples of five provenances

不同種源地的長柄扁桃仁多酚提取液也表現(xiàn)出了不同的總還原力。采自烏審旗的樣品FRAP值為（117.36±2.56）μmol·g-1，總還原力顯著強(qiáng)于另外4個種源地樣品（p＜0.05），神木次之，F(xiàn)RAP值為（112.49±1.55）μmol·g-1，豐寧樣品FRAP值為（45.56±1.82）μmol·g-1。

綜上可知，采自陜北神木、榆陽、烏審旗地區(qū)的長柄扁桃仁的自由基清除能力以及總還原力相對高于其他2個種源地區(qū)，初步說明在適宜的環(huán)境中生長的長柄扁桃中的仁表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性。

3 結(jié)論與討論

目前，國內(nèi)外對于多酚類物質(zhì)的研究主要集中在核桃、茶樹［9，11］等方面，而對長柄扁桃仁中多酚物質(zhì)的含量及其抗氧化活性等報道較少。本試驗以陜西榆陽地區(qū)長柄扁桃仁為材料，通過單因素和正交試驗確定了長柄扁桃仁中多酚的最佳提取工藝為∶乙醇體積分?jǐn)?shù)20%，料液比1g∶20mL，提取溫度40℃，超聲時間60min，提取率為2.076mg·g-1。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為0，即用水進(jìn)行提取時，多酚提取率為（1.927±0.163）mg·g-1，與乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時提取效果無顯著差異（p＜0.05），故可進(jìn)一步研究用于生產(chǎn)應(yīng)用。綜上所述，對長柄扁桃仁中多酚提取工藝研究對提高長柄扁桃綜合利用率有著重要的理論價值。

正交試驗表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對長柄扁桃仁中多酚的提取影響顯著強(qiáng)于時間和溫度。高體積分?jǐn)?shù)的乙醇會使得其他醇溶性雜質(zhì)等溶出，與多酚競爭乙醇-水分子；當(dāng)乙醇使用量足夠時，多酚的溶解基本達(dá)到飽和，用量過多時，產(chǎn)生溶解雜質(zhì)較多的同時，因抽濾階段無法密封，而經(jīng)歷一定溫度提取后抽濾耗時又較長，容易造成多酚的揮發(fā)。因此提取過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比比較敏感。由于多酚的結(jié)構(gòu)類型多，分子量跨度范圍較大，與蛋白質(zhì)的連接鍵牢固程度不一樣［35］，所以提取過程中各因素對多酚提取量的影響差異也較大。

表5 不同種源地樣品抗氧化活性比較Table 5 The antioxidant activity of the samples of five provenances

本試驗運(yùn)用DPPH法、ABTS法及FRAP法對5個不同種源地的長柄扁桃仁中多酚提取液抗氧化活性進(jìn)行了研究，采自陜北神木、榆陽、烏審旗3個縣區(qū)的樣品表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性，固陽、豐寧樣品相對較差。長柄扁桃長期生長在西北干旱、半干旱地區(qū)，在陜北地區(qū)有集中分布，在適宜環(huán)境中生長的長柄扁桃中的仁有效成分含量較高，故表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性。干旱是限制植物分布和生長的主要非生物因素［14］，而豐寧地處中溫帶半濕潤半干旱氣候區(qū)，不利于長柄扁桃次生代謝產(chǎn)物的累積，導(dǎo)致其抗氧化活性較差。長柄扁桃仁中多酚抗氧化活性與環(huán)境因素的關(guān)系有待進(jìn)一步的研究。

長柄扁桃抗旱、抗風(fēng)蝕、適應(yīng)范圍廣的優(yōu)良特性使得它可在西北干旱、半干旱地區(qū)廣泛種植，具有巨大的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)利用潛力［4］。但針對其各部位的利用研究尚未完全展開，有待于進(jìn)一步的綜合開發(fā)利用，為生產(chǎn)應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。

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