美洲黑楊×青楊派雜種無性系苗期抗寒性的鑒定與篩選

李曉東，樊軍鋒＊，邱 興，呂小鋒

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵712100；2.隴縣八渡林場，陜西 隴縣721200）

楊樹，楊柳科（Salicaceae）楊屬（Populus L.），多年生木本植物，喬木，樹體高大，雌雄異株［1］，是當(dāng)今世界中緯度地區(qū)栽培面積最廣的一個樹種。楊樹用途廣泛，既可作為加工業(yè)原料，也可作為民用材，還被廣泛用作防護(hù)林樹種［2］、園林景觀樹種和能源樹種［3］，越來越受到人們的重視。近年來，隨著人工雜交優(yōu)良楊樹品種和豐產(chǎn)栽培技術(shù)的廣泛應(yīng)用，我國楊樹造林面積不斷擴(kuò)大，現(xiàn)已成為世界上楊樹人工林面積最大的國家［4］。但是，在我國北方地區(qū)，特別是“三北”及更高緯度的地區(qū)，楊樹生長過程中常會遭到低溫脅迫，尤其是在晚秋和早春時期。由于現(xiàn)有的許多速生豐產(chǎn)系不耐低溫，氣溫的驟降會對樹木產(chǎn)生極大傷害［5］，造成減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，難以充分發(fā)揮其優(yōu)良特性，低溫寒害和凍害已成為我國北方擴(kuò)大楊樹栽種區(qū)域的主要限制因子。

目前評定林木抗寒性的主要指標(biāo)為形態(tài)、生理生化和代謝指標(biāo)［6］。植物抗寒性是植物在對低溫環(huán)境長期的適應(yīng)中，通過自身的遺傳變異和自然選擇而獲得的一種適應(yīng)性［7］，而其低溫適應(yīng)的過程，與大量的生理生化反應(yīng)密切相關(guān)［8］，通過對這些生理生化反應(yīng)中關(guān)鍵生理指標(biāo)的檢測可以確定植物的抗寒性。本試驗采用人工低溫脅迫的方法對西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院楊樹良種選育課題組經(jīng)多年篩選的美洲黑楊（Populus deltoids）×青楊派（Section tacamahaca）7個優(yōu)良雜種無性系進(jìn)行處理，測定與抗寒有關(guān)的生理指標(biāo)并進(jìn)行分析，綜合評價它們的抗寒性，篩選出抗寒力較強(qiáng)的無性系，以期為抗寒優(yōu)良新品種的選育、推廣和合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院楊樹良種選育課題組經(jīng)多年篩選的美洲黑楊（Populus deltoids）×青楊派（Section tacamahaca）7個優(yōu)良雜種無性系為供試樹種，以中綏12和陜林4號為對照。其中，中綏12號是中國林科院林研所及黑龍江省綏化林業(yè)局選育出的速生楊新品種，主干通直，樹姿美觀，穩(wěn)定性好，適應(yīng)廣泛，材質(zhì)優(yōu)良，耐嚴(yán)寒；陜林4號是西北農(nóng)林科技大學(xué)林科院選育出的優(yōu)良品種，樹干通直，生長迅速，材質(zhì)好，適應(yīng)性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抗寒性。9個樣本均取自西北農(nóng)林科技大學(xué)渭河試驗站。于2014年1月中旬在試驗站苗圃選取各無性系地徑約2cm、無病蟲害的1年生休眠苗10株，掛牌標(biāo)記后帶回實驗室，用于各項指標(biāo)的測定。

1.2 試驗處理

將各無性系試驗材料剪成20cm的枝段，先用自來水沖洗，再用去離子水漂洗3次，用濾紙吸干，分成2份，一份置于無暖氣的室內(nèi)用于枝條失水率的測定，另一份放入塑料自封袋，置于超低溫冰箱，采用梯度降溫法進(jìn)行低溫脅迫處理。設(shè)定的溫度梯度分別為-15℃、-20℃、-25℃、-30℃與-35℃，并以常溫（CK）為對照。降溫速率為4℃·h-1，達(dá)到所需溫度后繼續(xù)維持24h，每間隔5℃取出一批枝條用于相對電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和可溶性蛋白含量的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 枝條失水率測定 將沖洗干凈的各無性系材料，分別剪成長為10cm的枝段，混合均勻，稱重后置于無暖氣的室內(nèi)，每24h稱重1次，連續(xù)測定8 d［9］，計算公式為：枝條失水率=（T1-T2）／T1×100%，式中：T1為最初鮮重；T2為測定點(diǎn)重，各無性系重復(fù)3次。

1.3.2 相對電導(dǎo)率的測定 將低溫處理后的各無性系材料截成0.5cm的小段，混勻后用去離子水沖洗3次，分別稱取約1g放入錐形瓶中，加入去離子水25mL，搖勻后浸提24h，用雷磁DDS-307A型電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率；然后再將樣品放入沸水浴中煮30min，取出冷卻后搖勻，再用電導(dǎo)率儀測定其電導(dǎo)率［10］。計算公式為：相對導(dǎo)電率=C1／C2×100%，式中：C1為煮前電導(dǎo)率；C2為煮后電導(dǎo)率，各無性系重復(fù)3次。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量測定 采用硫代巴比妥酸（TBA）法［11］、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用NBT光化還原法［12］、過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法［12］、可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法［11］，各無性系重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用 Excel 2003進(jìn)行處理；采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較；半致死溫度（LT50）采用不同溫度處理下的相對電導(dǎo)率與Logistic方程相結(jié)合的方法［13］，求出不同類型楊樹的低溫半致死溫度（LT50），Logistic方程的表達(dá)式為：y=k／（1+ae-bx）（a、b、k均＞0），式中：y為相對電導(dǎo)率（%），x為處理溫度（℃），k為細(xì)胞傷害率的飽和容量，a、b為方程參數(shù)，LT50=（lna）／b。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同無性系的枝條失水率與抗寒性

枝條失水率是樹木越冬能力強(qiáng)弱的標(biāo)志之一，在低溫條件下抗寒性強(qiáng)的樹種常常具有較高的保水能力［14］。從表1可以看出，隨著處理時間的延長，各無性系的枝條失水率均呈現(xiàn)增加的趨勢，且不同無性系間的枝條失水率差異極顯著（p＜0.01），無性系07-69×青1的枝條失水率最低，8d后的枝條失水率為32.91%，說明其枝條在冬季保持體內(nèi)水分能力最強(qiáng)，抗寒能力最強(qiáng)；無性系06-57×川1、06-69×卜1、中綏12的枝條失水率較低，8d后的枝條失水率在34%～37%，保水能力表現(xiàn)較強(qiáng)，抗寒性較強(qiáng)；另外5個無性系8d后的枝條失水率都在40%以上，保水能力表現(xiàn)較差，抗寒性較弱；保水能力最強(qiáng)的無性系07-69×青1的枝條失水率比對照無性系陜林4號和中綏12分別低9.70%和2.91%。

表1 不同時間處理對各無性系枝條失水率的影響Table 1 Effects of different processing periods on dehydration rate of nine poplar clones %

2.2 不同低溫處理下各無性系的半致死（溫L度T50）

根據(jù)相對電導(dǎo)率的變化趨勢結(jié)合Logistic方程，求出各無性系的LT50值（表2）。結(jié)果表明，各無性系的LT50差異極顯著（p＜0.01），LT50在-45℃～-19℃之間。根據(jù)各無性系的LT50，可以將抗寒性大致分為4類：第1類為抗寒性最強(qiáng)的，LT50在-40℃以下，包括無性系07-69×青1和06-57×川1；第2類為抗寒性強(qiáng)的，LT50在-30℃以下，包括無性系06-69×卜1、07-西大寨×卜1和中綏12；第3類為抗寒性較強(qiáng)的，LT50在-26℃左右，包括無性系陜林4號和08-69×青2；第4類為抗寒性較弱的，LT50在-20℃左右，包括無性系08-69×青4和E24-01。

各無性系按LT50從低到高的順序依次為：07-69×青1＞06-57×川1＞06-69×卜1＞ 中綏12＞07-西大寨×卜1＞ 陜林4號 ＞08-69×青2＞08-69×青4＞E24-01。其中無性系07-69×青1的LT50最低，抗寒性最強(qiáng)；無性系E24-01的LT50最高，抗寒性最弱。07-69×青1與E24-01 2個無性系的LT50差值達(dá)到25℃左右，可見，9個無性系間抗寒性差異較大，可進(jìn)行無性系間選擇。

表2 低溫處理下各無性系的Logistic方程及其半致死溫度Table 2 Logistic equation of nine poplar clones under different low temperatures and estimation of LT50

2.3 不同低溫脅迫對各無性系生理指標(biāo)的影響

2.3.1 不同溫度處理下各無性系生理指標(biāo)的變化 分別測定不同溫度下各無性系枝條中丙二醛（MDA）和可溶性蛋白（SP）的含量以及SOD和POD的酶活性，取其平均值列于表3。由表3可知，不同低溫處理下各無性系枝條中的丙二醛（MDA）、可溶性蛋白（SP）、SOD和POD這4個生理指標(biāo)差距明顯，無性系07-69×青1枝條中的可溶性蛋白（SP）含量及SOD和POD活性始終明顯高于其他8個無性系，丙二醛（MDA）含量則始終低于其他無性系。其中無性系07-69×青1枝條中的丙二醛（MDA）含量比對照無性系陜林4號和中綏12分別低35.84%和17.66%，可溶性蛋白（SP）含量比對照無性系陜林4號和中綏12分別高70.60%和12.90%；SOD活性比對照無性系陜林4號和中綏12分別高19.49%和8.05%；POD活性比對照無性系陜林4號和中綏12分別高39.82%和23.55%。丙二醛（MDA）的含量與植物抗寒性呈負(fù)相關(guān)［15］，抗寒性強(qiáng)的無性系SOD和POD等酶活性較高［16］，由此可以推斷，無性系07-69×青1的抗寒性較其他強(qiáng)。

表3 低溫處理對各無性系生理指標(biāo)的影響Table 3 Effects of different temperature stress on physiological indicators of nine poplar clones

2.3.2 不同溫度處理下抗寒無性系07-69×青1生理指標(biāo)的變化 在低溫脅迫下，無性系07-69×青1枝條中丙二醛（MDA）和可溶性蛋白（SP）含量、SOD和POD活性如表4所示，通過對不同溫度處理后各項生理指標(biāo)的方差分析可知，低溫脅迫下無性系07-69×青1枝條中丙二醛（MDA）和可溶性蛋白（SP）含量、SOD和POD活性在各溫度處理條件下差異極顯著（p＜0.01）。

無性系07-69×青1枝條中，丙二醛含量變化趨勢表現(xiàn)為丙二醛含量隨著處理溫度的降低而升高，呈現(xiàn)為“S”型曲線，在-35℃處理時丙二醛的含量達(dá)到峰值，為9.89mmol·g-1，與對照相比，其相對增幅為289.37%；可溶性蛋白含量隨著處理溫度的降低，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在-25℃處理時可溶性蛋白的含量達(dá)到峰值，為17.87mg·g-1，與對照相比，其相對增幅為30.72%；在低溫處理下，SOD活性隨著處理溫度的降低先升高后下降，在-25℃處理時SOD活性達(dá)到峰值，為335U·g-1·h-1，與對照相比，其相對增幅為43.16%；在低溫處理下，POD活性隨著處理溫度的降低先升高后下降，在-25℃處理時POD活性達(dá)到峰值，為6010U·g-1·min-1，與對照相比，其相對增幅為77.71%。由此推斷，低溫脅迫造成了無性系07-69×青1枝條細(xì)胞內(nèi)的劇烈損傷，細(xì)胞膜脂過氧化作用增強(qiáng)，使得膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量增加，并導(dǎo)致了枝條細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白（SP）含量及SOD和POD等保護(hù)酶活性的變化。

表4 低溫處理對07-69×青1生理指標(biāo)的影響Table 4 Effects of different temperature stress on physiological indicators of 07-69×P.cathayana1

2.4 不同鑒定指標(biāo)間的相關(guān)性分析

表5反映了半致死溫度（LT50）、枝條失水率、MDA、SOD、POD和可溶性蛋白共6個生理指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣，從表5得知，半致死溫度（LT50）、枝條失水率都與MDA含量呈極顯著正相關(guān)，但與可溶性蛋白、SOD和POD均呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.75以上，由此說明，半致死溫度（LT50）和枝條失水率這兩項指標(biāo)能較大程度反映出材料的抗寒能力，且各個生理指標(biāo)間具有較大的相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞膜作為細(xì)胞對外界的屏障，在植物遭受低溫脅迫時，其膜脂物相會發(fā)生變化［17］，同時，植物為了避免凍害，提高自身的抗寒能力，會使機(jī)體的保水力、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、細(xì)胞膜透性、膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物以及抗氧化物酶系等產(chǎn)生一系列相應(yīng)的變化［18］。本研究結(jié)果表明：各無性系的枝條失水率、丙二醛（MDA）含量與其半致死溫度（LT50）呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，這與楊敏生［14］等的研究結(jié)果相一致。一般認(rèn)為可溶性蛋白作為一種低溫誘導(dǎo)蛋白，隨著低溫鍛煉的進(jìn)行，其含量與植物的抗寒性呈正比［19］，本研究也證實了這種結(jié)果；此外，SOD和POD酶活性與其半致死溫度（LT50）也呈極顯著負(fù)相關(guān)，這說明，運(yùn)用上述這些指標(biāo)均可以準(zhǔn)確反映和鑒定無性系的抗寒力，可以作為楊樹抗寒性評價的有效指標(biāo)。

表5 各抗寒指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 5 Correlation matrix

本研究利用枝條失水率、半致死溫度、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性和過氧化物酶活性等6項生理指標(biāo)對9個供試楊樹無性系抗寒性進(jìn)行綜合評價，結(jié)果表明：9個供試楊樹無性系的抗寒能力由大到小依次為07-69×青1＞06-57×川1＞06-69×卜1＞中綏12＞07-西大寨×卜1＞ 陜林4號 ＞08-69×青2＞08-69×青4＞E24-01。其中，無性系07-69×青1在9個供試的楊樹無性系中具有最強(qiáng)的抗寒能力，其半致死溫度（LT50）更是達(dá)到-45℃左右，對低溫的適應(yīng)能力要遠(yuǎn)強(qiáng)于抗寒性較好的對照品種陜林4號和中綏12，表明無性系07-69×青1可作為楊樹耐寒品種，在我國北方地區(qū)或“三北”及其以外更高緯度的地區(qū)進(jìn)行推廣栽培；亦可作為優(yōu)良種質(zhì)資源，進(jìn)行抗寒新品種的選育。

［1］ 張志毅，于雪松.楊樹生殖生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，22（6）：69-74.ZHANG Z Y，YU X S.Advances in reproduction biology of poplars［J］.Journal of Beijing Forestry University，2000，22（6）：69-74.（in Chinese）

［2］ 張德強(qiáng)，張志毅，楊凱.楊樹分子標(biāo)記研究進(jìn)展［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，22（6）：79-84.ZHANG D Q，ZHANG Z Y，YANG K.Advances of molecular marker researches in poplar［J］.Journal of Beijing Forestry University，2000，22（6）：79-84.（in Chinese）

［3］ HASEGAWA P M，BRESSAN R A，PARDO J M.The dawn of plant salt tolerance genetics［J］.Trends in Plant Science，2000，5（8）：317-319.

［4］ 林善枝，張志毅.楊樹抗凍性的研究現(xiàn)狀［J］.植物學(xué)通報，2001，18（3）：318-324.

［5］ 胡建芳，陳建中，姚延梼.楊樹抗寒性研究進(jìn)展［J］.世界林業(yè)研究，2011，24（3）：32-36.HU J F，CHEN J Z，YAO Y T.Research progress of cold resistance of poplar ［J］.World Forestry Research，2011，24（3）：32-36.（in Chinese）

［6］ 史清華，高建社，王軍，等.5個楊樹無性系抗寒性的測定與評價［J］.西北植物學(xué)報，2003，23（11）：1937-1941.SHI Q H，GAO J S，WANG J，et al.Determination and eval-uation of cold resistance of 5poplar clones［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica ，2003，23（11）：1937-1941.（in Chinese）

［7］ 陳立松，劉星輝.果樹逆境生理［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

［8］ HUGHES M A，DUNN M A.The molecular biology of plant acclimation to low temperature［J］.Journal of Experimental Botany，1996，47（3）：291-305.

［9］ 李夷平，孫慧珍，李海朝.移栽興安落葉松幼樹水分飽和虧缺及保水力初步研究［J］.林業(yè)科技，2009，34（6）：11-13.

［10］ 周永學(xué)，龔月樺，樊軍鋒.4種松樹抗寒性的比較［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2011，26（5）：69-71.ZHOU Y X，GONG Y H，F(xiàn)AN J F.Comparison on cold resistance of 4pine conifers［J］.Journal of Northwest Forestry University，2011，26（5）：69-71.（in Chinese）

［11］ 鄒琦.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［12］ 李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2004.

［13］ 王飛，陳登文，高愛琴，等.杏品種一年生休眠枝、花、幼果抗寒的相關(guān)分析［J］.西北植物學(xué)報，1999，19（4）：618-622.

［14］ 楊敏生，王春榮，裴保華.白楊雜種無性系的抗寒性［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，25（4）：20-23.YANG M S，WANG C R，PEI B H.Cold resistance of hybrid clone of white poplar［J］.Journal of Northeast Forestry University，1997，25（4）：20-23.（in Chinese）

［15］ 任建偉.引進(jìn)優(yōu)良楊樹雜種無性系組培繁殖及抗寒性研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［16］ 楊敏生，裴保華，程志鵬.白楊雜種無性系抗寒性生理指標(biāo)動態(tài)分析［J］.植物生態(tài)學(xué)報，1997，21（4）：367-375.YANG M S，PEI B H，CHENG Z P.Physiologic indexes of cold resistance in hybrid white poplar clones［J］.Acta Phytoecologica Sinica，1997，21（4）：367-375.（in Chinese）

［17］ 沈漫，王明庥，黃敏仁.植物抗寒機(jī)理研究進(jìn)展［J］植物學(xué)通報，1997，14（2）：1-8.

［18］ 邱乾棟，呂曉貞，臧德奎，等.植物抗寒生理研究進(jìn)展［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，8：53-57.

［19］ 高京草，王長柱，王進(jìn)國，等.棗樹抗寒性測定方法研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，2011，26（5）：72-75.GAO J C，WANG C Z，WANG J G，et al.Determination methods of cold resistance of Chinese jujube［J］.Journal of Northwest Forestry University，2011，26（5）：72-75.（in Chinese）