番茄黑斑病病原菌的鑒定及生物學(xué)特性研究

喬鏡澄+劉宇+馬敬昊+王謙

摘要：從天津地區(qū)產(chǎn)的番茄黑斑病的疑似樣本中分離得到5株形態(tài)相近的內(nèi)生真菌，對(duì)其形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，該菌為鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Kiessler]，PDA為其最適宜生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；菌絲在5～37 ℃ 范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適的生長(zhǎng)溫度和孢子萌發(fā)溫度為28 ℃，病原菌的致死溫度為65 ℃處理20 min，菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的最適pH值為6，黑暗條件最適合菌絲生長(zhǎng)，分生孢子在黑暗條件下萌發(fā)率最高；該病原菌對(duì)碳源、氮源選擇不苛刻，最適的碳源為乳糖，氮源為酵母膏。

關(guān)鍵詞：番茄；黑斑?。徊≡b定；生物學(xué)特性；致死溫度；最適生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)： S436.412.1+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0094-03

番茄黑斑病是番茄常見的病害之一，此病是由半知菌亞門番茄鏈格孢真菌[Alternaria tomato （CKe.） Weber]侵染引起的，鏈格孢菌是茄科植物中危害較大的病害之一。該病不僅發(fā)生在田間，更是采后貯藏過程中的重要病害，可侵染番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科類蔬菜，主要通過氣孔、皮孔、傷口或表皮侵入果實(shí)，在適宜的條件下產(chǎn)生大量孢子，對(duì)果實(shí)造成嚴(yán)重危害[1]。

研究表明，鏈格孢菌所產(chǎn)生的選擇性毒素對(duì)植物有致病性，對(duì)人體健康也有一定的影響[1]，所以研究鏈格孢菌的生長(zhǎng)特性，探究鏈格孢菌在不同溫度、pH值、光照、碳源和氮源下的菌落長(zhǎng)勢(shì)、直徑、菌絲生長(zhǎng)速率、菌絲干質(zhì)量、產(chǎn)孢量的變化，可以探明鏈格孢菌在不同條件下的生長(zhǎng)趨勢(shì)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

PDA固體培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g瓊脂，20 g葡萄糖，加水補(bǔ)足1 000 mL。PCA固體培養(yǎng)基：5 g胰蛋白胨，2.5 g酵母浸粉，1.0 g葡萄糖，20 g瓊脂，pH值為7，加水補(bǔ)足 1 000 mL。胡蘿卜固體培養(yǎng)基：將胡蘿卜去皮后稱取200 g，20 g瓊脂，加水補(bǔ)足1 000 mL。番茄果肉固體培養(yǎng)基：200 g番茄，20 g瓊脂，加水補(bǔ)足1 000 mL。V8果汁固體培養(yǎng)基：罐裝V8果汁200 mL，20 g瓊脂，加水補(bǔ)足1 000 mL。查彼（Czapek）固體培養(yǎng)基：2 g NaNO3，1 g K2HPO4，0.5 g KCl，0.5 g MgSO4，0.01 g FeSO4，30 g蔗糖，20 g瓊脂，加水補(bǔ)足 1 000 mL。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌的分離

根據(jù)方仲達(dá)的方法[2]，對(duì)番茄發(fā)病處病原菌進(jìn)行分離，采用單孢子分離法獲得純化菌株，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后保存?zhèn)溆?。生物學(xué)特性研究以所獲得的純化菌株tomato（b）為供試菌株。

1.2.2病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上活化，25 ℃恒溫培養(yǎng)6 d后，用無菌水制成一定濃度的孢子懸液，同時(shí)觀察菌落顏色、大小、形狀及分生孢子的形態(tài)和顏色，從而進(jìn)行病原菌的鑒定。

1.3生物學(xué)特性的研究

1.3.1溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響[3]

用打孔器將菌體轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上，分別置于1、4、15、25、28、30、37、40 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，黑暗條件下培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，采用小室培養(yǎng)法，將孢子懸液滴于凹玻片上，置于以上條件下培養(yǎng)3、6、12 h后，分別檢查孢子萌發(fā)率。使用棉藍(lán)乳酚油固定孢子懸液，鏡檢200個(gè)孢子，記下萌發(fā)的孢子數(shù)量，計(jì)算萌發(fā)率。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.2pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值和孢子懸液的pH值為3～12。分別置于28 ℃恒溫、黑暗條件下和小室恒溫培養(yǎng)，觀察菌落直徑，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.3.3光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

將接入菌塊的PDA培養(yǎng)基和孢子懸浮液，分別在光—暗周期為12 h—12 h、完全光照和完全黑暗3種處理?xiàng)l件下，于28 ℃恒溫培養(yǎng)。觀察菌落直徑，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.3.4不同培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

分別以PDA、PCA、番茄果肉固體培養(yǎng)基、V8果汁固體培養(yǎng)基和胡蘿卜固體培養(yǎng)基用打孔器將菌體轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基中心位置，置于28 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑。每個(gè)樣品3次重復(fù)，計(jì)算平均值。

1.3.5不同碳源和氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響[4]

選取D-木糖、D-果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖等量替換查彼培養(yǎng)基中的碳源（蔗糖），使得各個(gè)不同碳源培養(yǎng)基中碳的含量相同；用不加碳源的培養(yǎng)基作為對(duì)照。

選取L-谷氨酸、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等量替換查彼培養(yǎng)基中的氮源（硝酸鈉），使得各個(gè)不同碳源培養(yǎng)基中氮的含量相同；用不加氮源的培養(yǎng)基作為對(duì)照。

將菌塊轉(zhuǎn)接到PDA固體平板中央，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3、6 d后用十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，對(duì)照平行組計(jì)算出平均數(shù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6光照對(duì)菌株生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

將菌塊轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基內(nèi)，分別在光—暗周期為12 h—12 h、完全光照（全光）和完全黑暗（無光）3種處理?xiàng)l件下，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；3、6 d 后測(cè)量菌落的直徑，對(duì)照平行組計(jì)算出平均數(shù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

將制備好的孢子懸浮液滴于凹玻片上，分別在光—暗周期為12 h—12 h、完全光照和完全黑暗3種處理?xiàng)l件下，28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6、12 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.3.7致死溫度的確定

吸取1 mL孢子懸液至無菌試管中，分別置于40～65 ℃（以5 ℃為梯度）的恒溫水浴鍋中處理5～20 min后迅速冷卻。將處理后的孢子懸液滴于凹玻片上，28 ℃小室培養(yǎng)，12 h后觀察孢子萌發(fā)情況，測(cè)定孢子萌發(fā)率。

2結(jié)果與分析

2.1分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察

分離純化后獲得5株菌株，分別編號(hào)為tomato（a）、tomato（b）、tomato（c）、tomato（d）、tomato（e），將這些菌株培養(yǎng) 8 d 即可長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，該菌的基本形態(tài)特征為：在PDA培養(yǎng)基上，菌落較為致密，呈絮狀平鋪生長(zhǎng)，菌落最外層為灰白色，邊緣整齊，向內(nèi)為墨綠色，有較清晰的輪紋；分生孢子梗分隔，有橫縱隔膜，其中橫膈膜1～5個(gè)，縱隔膜0～3個(gè)，呈棕黃色，常多個(gè)呈鏈狀分布；單孢子短卵、橢圓或倒棍棒形（圖1）。根據(jù)該菌株的培養(yǎng)形狀及形態(tài)學(xué)特征，根據(jù)相關(guān)資料[5-10]，依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》的相關(guān)描述[11]，初步鑒定為鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Kiessler]。

2.2生物學(xué)特性

2.2.1溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知，在4、15、25、28、30、37 ℃中均可生長(zhǎng)，其中28 ℃為最佳生長(zhǎng)溫度，培養(yǎng)3、6 d后菌落平均直徑達(dá)到了30、50 mm，菌落生長(zhǎng)速度快，菌絲濃厚茂密，顏色呈黑色，菌落邊緣整齊。當(dāng)溫度小于15 ℃或大于37 ℃時(shí)，菌落生長(zhǎng)明顯受到抑制，菌絲變成灰白色，黑色孢子變少，菌落邊緣分辨不清，菌株有老化跡象；培養(yǎng)6 d后菌落直徑均小于30 mm。當(dāng)溫度為1、40 ℃時(shí)菌株不生長(zhǎng)，也無萌發(fā)跡象。黑色鏈格孢分生孢子在4～37 ℃范圍內(nèi)均可萌發(fā)，其中4 ℃下培養(yǎng)6 h萌發(fā)率最低，為6.0%；28 ℃下培養(yǎng)12 h萌發(fā)率最高，為97.6%。當(dāng)培養(yǎng)溫度小于15 ℃或大于37 ℃時(shí)，分生孢子萌發(fā)率明顯降低，培養(yǎng)12 h萌發(fā)率均低于35.0%；當(dāng)溫度小于4 ℃或大于37 ℃時(shí)，分生孢子則不能萌發(fā)。

2.2.2pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響[12]

由圖3可以看出，番茄黑色鏈格孢菌在pH值為3～12的PDA固體平板培養(yǎng)基中均可生長(zhǎng)，當(dāng)pH值為6時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度最快；當(dāng)pH值小于4或大于9時(shí)，菌株生長(zhǎng)明顯受到抑制。pH值為3～10時(shí)，培養(yǎng)12 h后平均有62.2%的病原菌孢子可以萌發(fā)；pH值為7時(shí)，病原菌孢子萌發(fā)率最高，培養(yǎng)12 h后萌發(fā)率為97.0%；當(dāng)pH值大于11時(shí)，孢子不能萌發(fā)。綜合考慮，菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的最適pH值選為6。

2.2.3光照條件對(duì)菌株生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

2.2.5不同碳源和氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

由圖4可以看出，致病菌在D-木糖、D-果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖等7種不同碳源查彼固體平板培養(yǎng)基中均可正常生長(zhǎng)，28 ℃培養(yǎng)3 d后，菌落平均直徑在23.75～38.00 mm 之間；培養(yǎng)6 d后差異明顯，菌落平均直徑在 37.59～62.50 mm之間。在供試的7種不同碳源培養(yǎng)基中，D-木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖菌落平均生長(zhǎng)直徑優(yōu)于其他培養(yǎng)基；其中，菌落生長(zhǎng)狀況最佳的為添加乳糖的查彼固體平板培養(yǎng)基，28 ℃中培養(yǎng)6 d后，菌落平均生長(zhǎng)直徑達(dá)到 62.50 mm，菌落生長(zhǎng)速度快，菌絲濃厚茂密，顏色呈黑色，菌落邊緣整齊；不加碳源的對(duì)照組則不生長(zhǎng)。

試驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，菌株在NaNO3、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-谷氨酸等6種不同氮源查彼固體平板培養(yǎng)基中均可正常生長(zhǎng)，28 ℃培養(yǎng)3 d后，菌落平均直徑在2500～43.00 mm之間；培養(yǎng)6 d后差異明顯，菌落平均直徑在 32.50～65.50 mm之間。在供試的6種不同碳源培養(yǎng)基中，NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏菌落平均生長(zhǎng)直徑優(yōu)于其他2種培養(yǎng)基；其中菌落生長(zhǎng)狀況最佳的為添加酵母膏的查彼固體平板培養(yǎng)基，28 ℃中培養(yǎng)6 d后，菌落平均生長(zhǎng)直徑達(dá)到65.50 mm，菌落生長(zhǎng)速度快，菌絲濃厚茂密，顏色呈黑色，菌落邊緣整齊；天冬酰胺則會(huì)抑制病原菌生長(zhǎng)，28 ℃培養(yǎng)6 d后，菌落平均直徑低于40.00 mm；不加氮源的對(duì)照組則沒有生長(zhǎng)。

2.2.6致死溫度的確定

試驗(yàn)結(jié)果得出，供試菌株分生孢子在40～45 ℃處理5～20 min均可正常萌發(fā)；50 ℃處理20 min時(shí)萌發(fā)率明顯降低，培養(yǎng)12 h后平均萌發(fā)率只有11%，且菌絲生長(zhǎng)受到影響；65 ℃處理15 min后平均萌發(fā)率較50 ℃處理20 min后更低，培養(yǎng)12 h后平均萌發(fā)率只有3%；65 ℃處理[CM（25]20[KG*3]min后，病原菌分生孢子不能萌發(fā)，由此可知，實(shí)驗(yàn)室供[CM）]

試菌株的致死溫度為65 ℃處理20 min，菌株有耐高溫屬性。

3討論與結(jié)論

重點(diǎn)對(duì)番茄鏈格孢菌的生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，此菌對(duì)PDA固體平板培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)利用率較高，生長(zhǎng)速度較快。致死溫度為65 ℃處理20 min；菌株生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的最適溫度為28 ℃；全黑暗培養(yǎng)下菌落生長(zhǎng)速度最快，全黑暗下孢子萌發(fā)率最高。根據(jù)以上結(jié)論可知，此菌株生長(zhǎng)特性與正常環(huán)境溫度、光照條件相似，所以可以在很短的時(shí)間內(nèi)侵染萌發(fā)、生長(zhǎng)擴(kuò)展，與其耐高溫、不喜光、營養(yǎng)選擇上的特性相同。

該菌株喜好偏酸至中性的生長(zhǎng)條件，與果肉和果實(shí)本身的pH值相近，與報(bào)道已知的病原菌一樣，菌株與寄主之間是相互作用的，這種特性有利于菌株本身的生長(zhǎng)發(fā)育[13-15]，推論其自身代謝物也有可能會(huì)對(duì)寄主本身的酸堿值造成一定的改變。

番茄鏈格孢菌對(duì)碳源、氮源的選擇不苛刻，常見碳氮源均可使其正常生長(zhǎng)，沒有規(guī)律性可言。對(duì)于碳源的選擇上，菌株在等量替換成乳糖的查彼固體平板培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)最快，蔗糖次之。在氮源的選擇上，菌株在等量替換成酵母膏的查彼固體平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最佳；天冬酰胺則有一定的抑制作用。

[HS2*2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：

[1]張?zhí)煊? 中國真菌志：第十六卷，鏈格孢屬[M]. 北京：科學(xué)出版社，2003.

[2]方仲達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[3]周曉榕，高翔，王新樂，等. 溫度對(duì)蠟蚧輪枝菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量及致病力的影響[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)（自然科學(xué)版），2005，26（4）：36-38.

[4]席興文，劉興強(qiáng)，王其峰，等. 不同氮源培養(yǎng)條件下鏈格孢菌培養(yǎng)差異初探[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，13（3）：75-76.[LM]

[5][JP3]鄒鳳蓮，汪志平，盧鋼. 番紅花鏈格孢菌的分離及其生物學(xué)特性研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2006，32（2）：162-167.[JP]

[6]周舒揚(yáng)，汪春蕾，喬志新，等. 玉米鏈格孢葉枯病病原菌的分子鑒定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（11）：261-263.

[7]嚴(yán)進(jìn)，施宗偉，宋福，等. 河北和山東鴨梨果實(shí)上鏈格孢菌鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2009，36（1）：37-43.

[8]崔進(jìn)龍，郭吉?jiǎng)?，范? 遠(yuǎn)志內(nèi)生真菌分離鑒定及活性篩選[J]. 微生物通報(bào)，2007，34（5）：839-842.

[9]周稚凡，黃偉，謝津，等. 鏈格孢菌抗植物病原真菌活性篩選[J]. 生物災(zāi)害科學(xué)，2013，36（3）：265-268.

[10]付娟妮，劉興華，蔡福帶. 石榴采后腐爛病病原菌的分子鑒定[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2005，22（5）：483-487.

[11]魏景超. 真菌鑒定手冊(cè)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[12]周銀麗，白建波，胡先奇，等. 芒果葉斑病病原菌的鑒定及其生物學(xué)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：108-109.

[13]羅志文，李向宏. 一種菠蘿果病病原初步鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，27（3）：1124-1129.

[14]Winton P W，Bates D H. Saturated solutions for the control of humisity in biological research[J]. Ecology，1960，41（1）：232-237.

[15]Di P P，Cappelli C，Katan T. Vegetative compatibility grouping of Fusarium oxysporum f.sp. gladioli from saffron[J]. European Journal of Plant Pathology，2002，108（9）：869-875.

[FQ）]