信號(hào)分子參與齦紫齦單胞菌調(diào)控牙齦上皮細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

摘要：齦紫齦單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）為黑色桿狀G+耐氧厭氧菌（aerotolerant anaerobes），可定殖、感染于口腔組織，并通過(guò)牙齦蛋白酶降解胞外基質(zhì)及細(xì)胞骨架蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞的入侵和胞內(nèi)自我復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn)，Pg定殖、感染后可促進(jìn)宿主細(xì)胞活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）釋放、介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子分泌，并在感染部位通過(guò)多通路調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡，引發(fā)牙周疾病。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Pg可調(diào)節(jié)牙周組織的中成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的凋亡活動(dòng)。Pg誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)是多因素共同作用的結(jié)果，本文主要從P2X7嘌呤受體及AKT/IP3信號(hào)對(duì)Pg調(diào)控牙齦上皮細(xì)胞（human gingival epithelial cells、HGEC）凋亡的作用研究進(jìn)展做一簡(jiǎn)要綜述。

關(guān)鍵詞：齦紫齦單胞菌；牙齦上皮細(xì)胞；P2X7受體；AKT/IP3信號(hào)；凋亡

牙周炎是由菌斑微生物引發(fā)，病原微生物與宿主反應(yīng)相互作用所致的一類導(dǎo)致牙周支持組織破壞，患牙咀嚼功能喪失的感染性疾病。細(xì)胞凋亡出現(xiàn)在慢性細(xì)菌感染所致的牙齦炎癥位點(diǎn)[1，2]，免疫組化研究揭示，牙周組織炎癥發(fā)生的早期即可觀察到牙周組織細(xì)胞的凋亡，表明牙周組織細(xì)胞凋亡與牙周炎的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。最近的研究證實(shí)Pg可通過(guò)牙齦上皮細(xì)胞表面的P2X7嘌呤受體介導(dǎo)其活性氧簇ROS釋放增加[3，4]。其產(chǎn)生的核苷二磷酸激酶（NDK）則抑制嘌呤受體P2X7介導(dǎo)的ATP升高引發(fā)的HGECs凋亡[5]。賴氨酸/精氨酸復(fù)合通過(guò)胞內(nèi)AKT/PI3Ks信號(hào)則對(duì)線粒體依賴凋亡相關(guān)細(xì)胞因子Bad、caspase-9產(chǎn)生活化抑制，從而抑制凋亡誘導(dǎo)引發(fā)的HGECs凋亡[8]?，F(xiàn)將有關(guān)Pg介導(dǎo)的凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制研究進(jìn)展簡(jiǎn)述如下。

1 ATP依賴嘌呤受體P2X7門(mén)控型離子通道參與Pg介導(dǎo)的牙齦上皮細(xì)胞（human gingival epithelial cells HGEC）凋亡調(diào)控

1.1 Pg核苷二磷酸激酶（NDK） 抑制嘌呤受體P2X7介導(dǎo)的HGEC凋亡作用 PG感染牙周組織時(shí)，ATP作為危險(xiǎn)信號(hào)胞外濃度升高并介導(dǎo)HGEC凋亡發(fā)生[3]。目前的研究認(rèn)為Pg外釋的核苷二磷酸激酶（NDK），可最大程度清除胞外ATP，從而抑制嘌呤受體P2X7介導(dǎo)的HGEC凋亡作用[4，5]。5mM ATP預(yù)處理GECs 1h后，鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ/碘化丙啶染色，流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示與未處理對(duì)照組相比凋亡水平顯著增加（P=0.02 student t-Text）。在使用P2X7選擇性抗體預(yù)處理的HGEC，其由ATP介導(dǎo)的凋亡受到顯著抑制。NDK基因敲除的變種Pg不再具有ATP介導(dǎo)凋亡效應(yīng)的抑制作用，重組的Pg源性NDK則可顯著抑制NDK基因敲除的變種Pg感染或未感染HGEC中ATP介導(dǎo)的早期P2X7質(zhì)膜穿孔效應(yīng)。Pg抑制ATP介導(dǎo)的HGEC凋亡效應(yīng)依賴于細(xì)胞膜表面的P2X7嘌呤受體。

1.2 Pg介導(dǎo)的HGEC 釋放 ROS依賴于P2X7受體途徑 炎癥環(huán)境中的ROS釋放是重要的宿主細(xì)胞防御反應(yīng)之一，牙周組織中的ROS主要由中性多形核粒細(xì)胞（PMN） 及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放[6]。ROS可同時(shí)介導(dǎo)宿主細(xì)胞及Pg病原體凋亡， Pg厭氧菌對(duì)抗環(huán)境中的氧化應(yīng)激不僅使可其在微氧的牙周袋中生存，同時(shí)使其躲避了固有免疫防御細(xì)胞通過(guò)呼吸氧爆發(fā)產(chǎn)生的清除作用[6]。目前的研究顯示，上皮細(xì)胞在胞外ATP升高時(shí)也會(huì)產(chǎn)生并釋放ROS。Eroy G Henry等用 3mM ATP刺激永生化人牙齦上皮細(xì)胞系KB后產(chǎn)生快速反應(yīng)，5min大量產(chǎn)生、30min后穩(wěn)定釋放ROS至少3h。使用P2X7選擇性抗體預(yù)處理該細(xì)胞后，在相同條件ATP刺激下永生化人牙齦上皮細(xì)胞產(chǎn)生凋亡刺激信號(hào)ROS的作用被顯著抑制。同樣使用P2X7 siRNA干預(yù)，永生化人牙齦上皮細(xì)胞對(duì)ATP刺激ROS產(chǎn)生受到明顯抑制。以上證據(jù)表明，感染發(fā)生時(shí)作為胞外危險(xiǎn)信號(hào)模式分子的胞外核苷酸ATP升高，打開(kāi)并通過(guò)門(mén)控型P2X7離子通道介導(dǎo)KB細(xì)胞產(chǎn)生并釋放ROS。ATP主要通過(guò)P2X7受體途徑介導(dǎo)此凋亡效應(yīng)[5]。

2 Pg通過(guò)AKT介導(dǎo)原代培養(yǎng)HGECs的線粒體凋亡抑制，調(diào)節(jié)HGECs中的促凋亡蛋白Bad分布及磷酸化

AKT也被稱為蛋白激酶B（PKB），是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）蛋白家族下游主要的效應(yīng)物。PI3K信號(hào)的活化參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)?；罨腁KT信號(hào)磷可酸化Bcl-2家族成員Bad，使其與14-3-3結(jié)合從而阻止Bad與Bcl-XL結(jié)合起動(dòng)線粒體凋亡。此外，AKT還可抑制關(guān)鍵的線粒體凋亡通路關(guān)鍵信號(hào)caspase-9的活性而阻止其下游凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活[7]，從而調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡進(jìn)程。其與Pg介導(dǎo)的HGECs凋亡關(guān)系研究如下。

2.1 AKT/PI3Ks信號(hào)介導(dǎo)Pg引發(fā)的 HGECs凋亡調(diào)節(jié) L.Yao等[7]以十字胞堿STS 2 M/4 M為陽(yáng)性對(duì)照組，對(duì)Pg ATCC 33277感染原代培養(yǎng)HGECs 2、6、12及24h，并分別于刺激前3h加入AKT siRNA 及AKT拮抗劑干預(yù)，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及促凋亡基因Bad表達(dá)水平、活化水平及細(xì)胞內(nèi)分布情況同時(shí)檢測(cè)線粒體依賴凋亡途徑的重要啟動(dòng)因子caspase-9的活化水平，結(jié)果顯示Pg ATCC 33277在BCR為100：1時(shí)對(duì)原代培養(yǎng)的HGECs凋亡水平?jīng)]有影響與空白對(duì)照組相當(dāng)。并抑制STS 2 M/4 M下對(duì)HGECs的凋亡介導(dǎo)作用。AKT敲除后的HGECs在相同Pg刺激條件下的凋亡率上升至正常凋亡率的3倍，在Pg與STS共同刺激下的凋亡率為正常凋亡率的4倍，并顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AKT siRNA對(duì)HGECs不具有凋亡介導(dǎo)作用。以AKT及PI3Ks抗結(jié)劑LY294002 20 M預(yù)處理AKT敲除后的HGECs， 在Pg與STS共同刺激下的凋亡率不發(fā)生進(jìn)一步的增加說(shuō)明，AKT/PI3Ks信號(hào)是Pg調(diào)節(jié)HGECs凋亡的關(guān)鍵因子之一。

2.2 AKT信號(hào)介導(dǎo)Pg感染HGECs中促凋亡基因Bad的轉(zhuǎn)錄抑制 Pg感染原代培養(yǎng)HGECs 24h后Bad mRNA水平下降60%，Pg感染AKT敲除后的HGECs 24h后Bad mRNA水平升高20%。單純敲除AKT后的HGECs Bad mRNA水平?jīng)]有變化說(shuō)明AKT信號(hào)介導(dǎo)了Pg感染的HGECs 中促凋亡基因Bad的轉(zhuǎn)錄抑制。

2.3 AKT信號(hào)介導(dǎo)Pg感染HGECs 中Bad胞質(zhì)分布調(diào)節(jié) 免疫熒光顯微鏡觀察Pg感染或非感染原代HGECs，Bad大量分布于胞質(zhì)內(nèi)，凋亡誘導(dǎo)劑STS刺激下的HGECs中Bad強(qiáng)染色出現(xiàn)在核周?chē)搮^(qū)域是典型的線粒體胞內(nèi)聚集區(qū)，而AKT敲除后的HGECs在Pg或STS及Pg和STS共同作用下均表現(xiàn)出Bad強(qiáng)染色分布于細(xì)核周區(qū)域。

2.4 Pg對(duì)HGECs中 caspase-9活化抑制存在AKT之外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與Pg對(duì)HGECs的凋亡抑制機(jī)制 Caspase-9作為線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子在Pg對(duì)HGECs的凋亡抑制過(guò)程中的變化契合在此過(guò)程中線粒體依賴凋亡通路的其他相關(guān)活化抑制研究結(jié)果。L.yao的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Pg感染HGECs后的最初30min～1h內(nèi)，活化的caspase-9與未作處理的HGECs對(duì)照組相比，出現(xiàn)輕微升高，但在2 、6、12、24h后急劇下降至對(duì)照組caspase-9活化水平的50%，加入STS 4 M后Pg感染HGECs早期的30min～2h可觀察到caspase-9活化水平顯著增加，然而6h后，活化caspase-9水平大幅下降至對(duì)照組水平以下。AKT敲除后HGECs與未敲除HGEC的scaspase-9活化水平在Pg及STS刺激下無(wú)差別。但AKT特意性抗結(jié)劑JAK-1（Pyridone 6），曾在以往的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)能夠阻截Pg對(duì)STS引發(fā)的HGECs caspase-3活化升高的抑制，對(duì)Pg感染的AKT缺如HGECs 中scaspase-9活化抑制沒(méi)有影響。由此證明，Pg可對(duì)HGECs中 caspase-9活化產(chǎn)生具有抑制作用，但線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵信號(hào)分子caspase-9活化抑制存在AKT之外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與Pg對(duì)HGECs的凋亡抑制機(jī)制。

綜上所述，Pg介導(dǎo)的凋亡抑制具有以下生化特征，ATP刺激發(fā)生時(shí)，P2X7受體構(gòu)象改變開(kāi)放陽(yáng)離子通道[9-11]，允許K+外流，并通過(guò)募集半孔道蛋白pannexin-1形成更大型的孔型通道激活NLRP3相關(guān)炎癥蛋白分泌[12-14]，并通過(guò)NADPH氧化酶及線粒體途徑而介導(dǎo)ROS產(chǎn)生釋放，Pg源性NDK清除胞外ATP，阻截了P2X7 介導(dǎo)的下游級(jí)聯(lián)活化，從而抑制了宿主細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[10，15-17]。凋亡刺激發(fā)生時(shí)，Pg調(diào)節(jié)線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)，限制細(xì)胞色素C釋放（Yilmaz 2004），抑制促凋亡蛋白Bad轉(zhuǎn)位至線粒體膜，與同源抗擊凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl結(jié)合，活化具有質(zhì)膜穿孔效應(yīng)的Bax二聚體形成線粒體外膜孔道，釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而進(jìn)一步啟動(dòng)下游的線粒體依賴的凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抑制作用發(fā)生。AKT信號(hào)活化可使HGECs中Bad表達(dá)水平下降，并使其磷酸化失去線粒體轉(zhuǎn)位功能，從而介導(dǎo)Pg抵抗宿主細(xì)胞凋亡進(jìn)程[7]。

牙齦上皮細(xì)胞作為口腔固有免疫防御的重要壁壘是最早被Pg定殖的宿主細(xì)胞之一（Schroeder and Listgarten，1997；Weinberg et al.，1998；Nisapakultorn et al.， 2001； Lamont and Yilmaz， 2002）。然而，PG對(duì)細(xì)胞凋亡的影響存在兩種相反的結(jié)論，凋亡抑制和介導(dǎo)凋亡都曾被報(bào)道。不同的pg菌株，不同的宿主防御，局部因素，例如感染劑量，暴露時(shí)間，都可導(dǎo)致?lián)p傷的跨度變化。這些pg對(duì)宿主細(xì)胞影響研究的不同結(jié)果差異與其說(shuō)是相互沖突不如說(shuō)是事實(shí)補(bǔ)充，在Pg 相對(duì)于細(xì)胞數(shù)量較少而暴露時(shí)間較短時(shí)，細(xì)菌胞內(nèi)侵襲[18、19]調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞生存延長(zhǎng)[20-22]，引發(fā)慢性牙周炎癥。而另一方面，pg相對(duì)細(xì)胞數(shù)量較多，暴露時(shí)間長(zhǎng)時(shí)，細(xì)菌的傷害可表現(xiàn)為介導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡[23]機(jī)制研究也證明，上述HGECs表面P2X7嘌呤受體既介導(dǎo)上皮細(xì)胞對(duì)Pg刺激產(chǎn)生的ROS釋放，胞外ATP引發(fā)的凋亡效應(yīng)，同時(shí)是Pg介導(dǎo)宿主細(xì)胞釋放NLRP3相關(guān)炎癥介質(zhì)的關(guān)鍵因子[15-17]。Pg精氨酸、賴氨酸牙齦蛋白酶通過(guò)水解細(xì)胞骨架蛋白、降解胞外基質(zhì)，破壞細(xì)胞間連接，引發(fā)胞內(nèi)凋亡信號(hào)分子活化抑制從而調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡，作為pg引發(fā)宿主細(xì)胞凋亡的必要條件，在感染位點(diǎn)既引發(fā)宿主細(xì)胞凋亡，也誘導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)[24，25]。

因此，盡管包括精氨酸、賴氨酸牙齦蛋白酶復(fù)合物[24，25]，NDK，信號(hào)分子Akt/ IP3、P2X7、Caspase3/9，、Bad等細(xì)菌毒力因子、細(xì)胞膜表面受體、胞內(nèi)信號(hào)/效應(yīng)蛋白參與被病原體介導(dǎo)牙齦上細(xì)胞凋亡逐步被證實(shí)，更多的分子機(jī)制也將被闡釋和明確。然而對(duì)Pg引發(fā)牙周疾病的機(jī)制研究?jī)H從單純的炎癥介導(dǎo)，或是從凋亡/壞死的調(diào)查上出發(fā)不足以揭示Pg此類可在宿主細(xì)胞定殖、入侵的機(jī)會(huì)致病菌引發(fā)組織疾病的真實(shí)過(guò)程，因而，牙周感染性疾病中，病原體、宿主免疫、凋亡介導(dǎo)之間的相互關(guān)聯(lián)變化在疾病初始、變遷中的生化特征應(yīng)作為未來(lái)對(duì)牙周疾病發(fā)病機(jī)理的重要部分而被加以研究。

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