外源性S100a8和S100a9與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究

摘要：目的 研究外源性S100a8和S100a9與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 Real-time PCR檢測巨噬細(xì)胞RAW264.7及結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT中S100a8和S100a9的基因表達(dá)水平；ELISA檢測RAW264.7及CT26.WT細(xì)胞分泌至胞外的S100a8和S100a9的蛋白含量。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測外源性S100a8和S100a9蛋白對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果 S100a8和S100a9在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于結(jié)腸癌細(xì)胞（P=0.0126；P=0.03）；外源性S100a8和S100a9均能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移（P=0.0128；P=0.0011）。結(jié)論 結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中S100a8和S100a9主要在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)和分泌，并發(fā)揮促結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用，有可能成為治療結(jié)腸癌進(jìn)展的新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸腫瘤；S100a8和S100a9；侵襲轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率呈逐年上升趨勢。我國結(jié)直腸癌發(fā)病率已躍居惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，其病死率高達(dá)45.5%[1]，而腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是腫瘤致死的重要因素。研究表明S100a8和S100a9在乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中高表達(dá)，且外源性的S100a8和S100a9與轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成密切相關(guān)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的在轉(zhuǎn)移部位的定植[2-5]。本實(shí)驗(yàn)著重闡述S100a8和S100a9在腫瘤微環(huán)境中的來源，并檢測外源性S100a8和S100a9對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

1 資料與方法

1.1主要細(xì)胞和試劑 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7均購自ATCC。主要試劑：引物和RNA抽提試劑盒Trizol（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）；熒光染料 SYBR Green Master Mix （Takara）；S100a8和S100a9 ELISA檢測試劑盒（USCNK Life Science）；小鼠S100a8和S100a9重組蛋白（Abnova）； Transwell 小室（Corning）；基質(zhì)膠（BD Biosciences）；MTT（Sigma）。

1.2方法 Primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，小鼠S100a8上游引物5'-GACAATGCCGTCTGAACTGG；GCTACTCCTTGTGGCTGTCTT-3'；小鼠S100a9上游引物5'-ACCACCATCATCGACACCTTC；AAAGGTTGCCAACTGTGCTTC-3'；RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Transwell實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100a8和S100a9在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于結(jié)腸癌細(xì)胞 Real-time PCR結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞RAW264.7中S100a8和S100a9的基因表達(dá)水平明顯高于結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT，P值分別為0.0126和0.03（圖1），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA方法同樣表明，巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌至胞外的S100a8和S100a9蛋白含量明顯高于結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT，P值分別為0.0128和0.0011（圖2），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Real-time PCR檢測巨噬細(xì)胞RAW264.7和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT中S100a8和S100a9的表達(dá)

圖2 ELISA檢測巨噬細(xì)胞RAW264.7和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT分泌的S100a8和S100a9

2.2外源性S100a8和S100a9促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移 4ug/ml的S100a8和S100a9蛋白分別刺激小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)觀測腫瘤細(xì)胞遷移能力。如圖3所示，外源性S100a8和S100a9蛋白均能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移，誘導(dǎo)傷口愈合。以同等濃度的S100a8和S100a9蛋白分別刺激CT26.WT，transwell實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，如圖4所示，外源性S100a8和S100a9蛋白均能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測外源性S100a8和S100a9蛋白對CT26.WT遷移能力的影響

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測外源性S100a8和S100a9蛋白對CT26.WT侵襲能力的影響

3 討論

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)，每年約有120萬新發(fā)病例，約有60萬人死于結(jié)直腸癌[6]。我國結(jié)直腸癌年增加率為4.2%，高于全球平均遞增速度。結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的演變過程，其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移是致死的重要原因。研究表明，腫瘤微環(huán)境中CXCL1、CCL2等多種細(xì)胞因子和趨化因子與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]。

S100a8和S100a9均屬于S100蛋白家族成員，為低分子量鈣結(jié)合蛋白，二者常以Ca2+ 依賴的方式形成S100a8/a9異源二聚體（又叫鈣衛(wèi)蛋白）發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]。S100a8/a9主要在粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓來源抑制細(xì)胞（MDSC）中表達(dá)，LPS、 TNF -a 、IL1β、 IL-10 、IL-22等炎癥因子刺激下S100a8和S100a9表達(dá)和分泌增強(qiáng)，且通常與TLR4和RAGE受體結(jié)合后激活多種信號通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，S100a8和S100a9主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)和分泌，在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)和分泌相對較少。

研究表明，S100a8/9參與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，且內(nèi)源性和外源性S100a8/a9對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移扮演的角色各不相同，此特性可能依賴于胞外S100a8/a9濃度的變化。研究基本認(rèn)為在20-250ug/ml濃度范圍內(nèi)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，小于20ug/ml的濃度促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[12-14]。本研究證實(shí)，低濃度（4ug/ml）的S100a8和S100a9蛋白均能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，上述結(jié)果表明，結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞高表達(dá)和分泌S100a8和S100a9從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，此研究結(jié)果為結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了新思路，為結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的診斷及靶向治療提供了重要的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cunningham D， Atkin W， Lenz H J et al. Colorectal cancer[J]. Lancet，2010，375：1030-1047. [2]Lukanidin E， Sleeman J P.Building the niche： the role of the S100 proteins in metastatic growth Semin[J]. Cancer Biol，2012，22：216-225.

[3]Saha A， Lee Y C， Zhang Z，et al. Lack of an endogenous anti-inflammatory protein in mice enhances colonization of B16F10 melanoma cells in the lungs[J]. J Biol Chem，2010，285 ：10822-10831.

[4]Hiratsuka S， Watanabe A， Sakurai Y，et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase[J]. Nat Cell Biol，2008，10：1349-1355.

[5]Rafii S， Lyden D.S100 chemokines mediate bookmarking of premetastatic niches[J]. Nat Cell Biol，2006，8：1321-1323.

[6]Brenner H， Kloor M， Pox C P.Colorectal cancer[J]. Lancet，2013.

[7]Acharyya S， Oskarsson T， Vanharanta S，et al. A CXCL1 paracrine network links cancer chemoresistance and metastasis[J]. Cell，2012，150：165-178.

[8]Li X， Xu Q， Wu Y，et al. A CCL2/ROS autoregulation loop is critical for cancer-associated fibroblasts-enhanced tumor growth of oral squamous cell carcinoma[J]. Carcinogenesis，2014.

[9]Ghavami S， Chitayat S， Hashemi M，et al. S100A8/A9： a Janus-faced molecule in cancer therapy and tumorgenesis[J]. Eur J Pharmacol，2009，625：73-83.

[10]Gebhardt C， Nemeth J， Angel P，et al. S100A8 and S100A9 in inflammation and cancer[J]. Biochem Pharmacol，2006，72：1622-1631.

[11]Goyette J， Geczy CL.Inflammation-associated S100 proteins： new mechanisms that regulate function[J]. Amino Acids，2011，41：821-842.

[12]Ghavami S， Rashedi I， Dattilo B M，et al. S100A8/A9 at low concentration promotes tumor cell growth via RAGE ligation and MAP kinase-dependent pathway[J]. J Leukoc Biol，2008，83： 1484-1492.

[13]Ghavami S， Chitayat S， Hashemi M，et al. S100A8/A9： a Janus-faced molecule in cancer therapy and tumorgenesis[J]. Eur J Pharmacol，2009，625：73-83.

[14]Turovskaya O， Foell D， Sinha P，et al. RAGE， carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis[J]. Carcinogenesis，2008，29：2035-2043.

編輯/哈濤