摘要:目的 構(gòu)建針對大鼠結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor ,CTGF) 的小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。方法 將體外合成的兩對各段含65堿基的寡核苷酸連接到pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,同時設(shè)立非特異對照。結(jié)果 酶切、DNA 序列鑒定均證實插入片段的正確性。結(jié)論 成功地構(gòu)建了鼠CTGF-siRNA熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。為進(jìn)一步研究其對體內(nèi)外抗纖維化作用打下基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞:CTGF; siRNA;熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體
RNA干擾(RNA in terference, RNA i)是抑制目標(biāo)基因的強(qiáng)有力的手段,人工合成的19-21核苷酸的干擾RNA在哺乳動物中能夠誘導(dǎo)序列專一性的RNA干擾作用,已經(jīng)在哺乳動物RNA干擾的分子機(jī)制方面鋪平了道路[1]。大量研究證明, 結(jié)締組織生長因子(CTGF) 是組織器官纖維化的關(guān)鍵和共同因子,可介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β等多種信號刺激的纖維化效應(yīng),以CTGF為特異性靶標(biāo)將給器官纖維化治療開創(chuàng)新紀(jì)元[2]。本研究通過設(shè)計針對大鼠CTGFmRNA的序列,構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA 的熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,旨在為進(jìn)一步應(yīng)用CTGF siRNAs抗纖維化研究創(chuàng)造條件。
1 資料與方法
1.1一般資料 pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體及JM109大腸桿菌菌種由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳國家重點實驗室提供, siRNA序列及引物由大連寶生生物公司合成。
1.2方法
1.2.1 siRNA作用靶序列的選擇 按照siRNA作用靶序列的設(shè)計要求[3],從大鼠CTGF基因最完整的編碼序列(序列號AF120275) 中設(shè)計4對序列分別為: T1序列為: 5′AgCTgACCTAgAggAAAAC,T2序列為: 5′AAgACACATTTggCCCTgA,T3序列為: 5′gTTCTAAgACCTgTgggAT,T4序列為: 5′CAggAAgATgTATggAgAC,陰性對照:CAgACAACTATgTACgTCg。經(jīng)過BLAST[4], 與同種屬的其它基因無同源性。
1.2.2.1退火 將正義和反義兩條鏈以100μM濃度1:1混合在PCR儀上95℃30s,72°C 2min,37°C for 2min,25°C for 2min。 行6%聚丙稀酰胺凝膠電泳,180V、30min,銀染后觀察退火是否成功。
1.2.2.2連接 pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體用EcorI、BamHI雙酶切完全后,跑膠,經(jīng)過純化后退火,加入10ulT4連接酶體系,在16℃水浴中連接12~16h。
1.2.2轉(zhuǎn)化(按分子克隆實驗指南進(jìn)行) 按常規(guī)操作方法連接并將重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM 109 后提取質(zhì)粒。
1.2.3酶切、測序鑒定 由于插入片段設(shè)計使連接后載體上形成新的酶切位點(MluI),選擇能被MluI單酶切的克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒送測序。測序引物序列為Forward Sequencing Primer: 5'-ATGATCATACTTACCGTAACGTTG-3'。測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。
2 結(jié)果
2.1酶切鑒定 連接后載體用MluI單酶切后行1%瓊脂糖凝膠電泳,顯示T1、 T2、T3、T4、T5組克隆出現(xiàn)大小約6.5kb的線形化條帶, 而陰性對照組為空質(zhì)粒pRZ。陽性質(zhì)粒分別命名為: pRZT1、 pRZT2、pRZT3、 pRZT4 、 pRZT5 ,見圖1(Fig 1)。
1: pRZT1; 2: pRZT2; 3: pRZT3; 4: pRZT4 ; 5: pRZT5 6: pRZ M: DNA/ Hind Ⅲ Marker
Fig1 Enzyme digestion analysis of pRZ-siRNA expression vectors
圖1 pRZ-siRNA重組質(zhì)粒酶切鑒定
2.2測序結(jié)果 CTGF-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒熒光載體測序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行拼接后顯示,連入序列正確,無突變。見圖2。
圖2 pRZ-siRNA重組質(zhì)粒測序拼接圖
3 討論
隨著人類基因治療技術(shù)的迅速發(fā)展,越來越多基因治療方案進(jìn)入臨床試驗,以逆轉(zhuǎn)錄病毒作為介導(dǎo)載體也是目前基礎(chǔ)和臨床研究中最常用的基因轉(zhuǎn)染方法。能在哺乳類細(xì)胞中直接表達(dá)siRNA 的質(zhì)粒載體系統(tǒng)的發(fā)明和改進(jìn)[5],使基于載體表達(dá)的方法制備siRNA最為優(yōu)越。質(zhì)粒、病毒類載體介導(dǎo)的siRNA表達(dá)方法的出現(xiàn),克服了化學(xué)合成與體外轉(zhuǎn)錄方法時siRNA進(jìn)入細(xì)胞后容易被降解,進(jìn)入細(xì)胞siRNA在細(xì)胞內(nèi)的RNAi效應(yīng)持續(xù)時間短等缺點。由于質(zhì)??梢詮?fù)制擴(kuò)增,相比起其它合成方法來說,這就能夠顯著降低制備siRNA的成本[6]。
我們選擇帶有ZsGreen熒光標(biāo)記的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSIREN- RetroQ-ZsGreen,將大鼠CTGF-siRNA克隆至該載體,進(jìn)行病毒包裝并篩選具有高滴度感染性重組病毒產(chǎn)生細(xì)胞系的研究。我們所采用的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)整合,大大提高siRNA表達(dá)載體對宿主細(xì)胞的侵染性,徹底克服某些細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低的障礙。我們通過熒光標(biāo)記很容易觀察到載體的轉(zhuǎn)染效率及目的基因的沉默效率。本研究針對大鼠CTGF基因構(gòu)建siRNA 的熒光逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,以期持續(xù)穩(wěn)定地抑制該基因的表達(dá),為延緩器官纖維化的基因治療提供一種可能途徑。
參考文獻(xiàn):
[1]Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature,2001,411:494-498.
[2]Rachfal, A.W., and Brigstock, D.R. Connective tissue growthfactor (CTGF/CCN2) in hepatic fibrosis[J]. Hepatol Res,2003 26: 1-9.
[3]http://bioinfo2.clontech.com/rnaidesigner/
[4]http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/Blast/
[5]Tripathi AK, UV Ramani, AK Patel,et al. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro[J]. Appl Biochem Biotechnol,2013,169(2):688-694. [6]Tripathi AK, UV Ramani, AK Patel,et al. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro[J]. Appl Biochem Biotechnol,2013,169(2):688-694. 編輯/哈濤