摘要:目的 建立劉寄奴中7-甲氧基香豆素的含量測(cè)定方法。方法 Agela Technologies C18色譜柱,以甲醇-水-冰醋酸(52:48:4)為流動(dòng)相,流速:0.8ml/min,檢測(cè)波長:322nm,柱溫:40℃。結(jié)果 7-甲氧基香豆素濃度在2.336~46.72ug/ml范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。回歸方程為y=120.93x+7.9298,相關(guān)系數(shù):R=1(n=6)。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好,可用于劉寄奴中7-甲氧基香豆素的含量測(cè)定。
關(guān)鍵詞:劉寄奴;7-甲氧基香豆素;HPLC
劉寄奴為菊科植物奇蒿Artemisia anomala S Moore的干燥地上部分。具有活血祛瘀,通經(jīng)止痛,解暑止瀉的功能。主治腹痛脹痛,月經(jīng)不調(diào),暑熱泄瀉,跌打損傷,金瘡出血,癰腫。劉寄奴主產(chǎn)于江蘇、浙江、江西等省。其含有木栓酮、β-谷甾醇、7-甲氧基香豆素、東莨菪亭、異嗪皮啶、胡蘿卜苷、咖啡酸等成分[1]。因7-甲氧基香豆素具有一定的生物活性,且性質(zhì)穩(wěn)定。筆者對(duì)劉寄奴中7-甲氧基香豆素的含量測(cè)定進(jìn)行系統(tǒng)探討,得出了操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的測(cè)定方法。為充分利用本地資源、更好地控制劉寄奴藥材質(zhì)量,創(chuàng)造了很好的條件。
1 儀器與試藥
安捷倫1200液相色譜儀(美國安捷倫公司),KQ100DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。7-甲氧基香豆素對(duì)照品來源于北京北研馨綠生物技術(shù)有限公司,純度>98%,含量測(cè)定用;甲醇為色譜純,水為超純水,其它試劑均為分析純。
2 色譜條件與測(cè)定條件
色譜柱為Agela Technologies C18色譜柱(250mm×4.6mm,5um),流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(52:48:4),流速為0.8ml/min,檢測(cè)波長為322nm,柱溫:40℃[2-4]。在此色譜條件下7-甲氧基香豆素與其它組分分離完全,保留時(shí)間為7.585min,理論塔板數(shù)為13195。見圖1。
圖1 對(duì)照品(A)與樣品(B)色譜圖
3 溶液的制備
3.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取7-甲氧基香豆素對(duì)照品11.68mg,置50ml量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為母液。取上述母液5ml,置50ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液[5]。
3.2供試品溶液的制備 取本品粉末(過二號(hào)篩)約0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25ml,稱定重量,超聲處理30min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
4 結(jié)果
4.1線性關(guān)系考察 分別取母液0.25、0.5、0.75、1.25、2.5、5ml置25ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,吸取20ul進(jìn)行高效液相測(cè)定,以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=120.93x+7.9298,相關(guān)系數(shù)R=1。表明:7-甲氧基香豆素濃度在2.336~46.72ug/ml范圍內(nèi),與峰面積呈良好線性關(guān)系。
4.2精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,以峰面積計(jì)算方法測(cè)定精密度,RSD為0.47%,顯示精密度良好。
4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批劉寄奴粉末6份,按照供試品溶液制備項(xiàng)下的方法操作,制得6份供試品溶液,測(cè)定并計(jì)算6份供試品溶液中7-甲氧基香豆素的含量,其RSD為0.9%。表明樣品按本標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn),重現(xiàn)性良好。
4.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果7-甲氧基香豆素含量的RSD為1.0%,表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。
4.5回收率測(cè)定 精密稱取已知含量的同批劉寄奴粉末(含量為1.4253mg/g)6份,每份約0.25g,分別精密加入7-甲氧基香豆素對(duì)照品溶液(濃度11.68ug/ml)25ml,按上述樣品溶液的制備方法和色譜條件進(jìn)行平行測(cè)定,見表1。
4.6樣品測(cè)定 按上述操作方法,測(cè)定8份來自不同產(chǎn)地的樣品,外標(biāo)法計(jì)算含量,見表2。
5 討論
5.1測(cè)定波長的選擇 取7-甲氧基香豆素對(duì)照品溶液,在200~400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描,結(jié)果在322nm處有最大吸收,故選擇322nm為測(cè)定波長。見圖2。
圖2 7-甲氧基香豆素對(duì)照品紫外掃描圖
5.2流動(dòng)相的選擇 在對(duì)流動(dòng)相的考察上,先采用甲醇-水(52:48),發(fā)現(xiàn)基線漂移。加入0.4%的冰醋酸溶液,分離效果不佳。進(jìn)而對(duì)其比例不斷的調(diào)整,至加入4%左右的冰醋酸溶液,主成分與其它雜質(zhì)峰得到良好的分離,且保留時(shí)間合適,峰形良好。
5.3提取溶劑和提取方法的選擇 采用甲醇、乙醇、流動(dòng)相三種不同溶劑,對(duì)其提取效果進(jìn)行比較,結(jié)果顯示甲醇超聲提取的含量最大,故選擇甲醇為提取溶劑,超聲為提取方法。
5.4提取體積的考察 分別精密加入不同體積甲醇,超聲提取30min,結(jié)果顯示加入甲醇25ml提取已比較完全,為節(jié)省成本,采用25ml甲醇超聲提取。
5.5提取時(shí)間的考察 精密加入甲醇25ml,分別超聲10、20、30、40min,結(jié)果表明,超聲30min可提取完全,故提取時(shí)間定為30min。
5.6影響藥材含量的因素 從上述測(cè)定結(jié)果可知,不同產(chǎn)地的劉寄奴7-甲氧基香豆素的含量有明顯差別,說明生態(tài)環(huán)境、采收時(shí)間及年限等差異對(duì)7-甲氧基香豆素的含量造成影響。
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編輯/哈濤