2011～2013年某市手足口病標本病毒檢測結果分析

摘要：目的 對2011～2013年某市手足口病病例的不同標本進行病原體檢測和分析，了解到本市的手足口病感染狀況。方法 對臨床診斷為手足口病的患者的糞便標本460份，咽拭子標本549份（EV陽性345份，EV71陽性23份，CA16陽性13份），用RT-PCR是實時熒光定量PCR檢測腸道通用病毒、CVA16和EV71，華山的急性期血清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測EV71和CAV16的IgM抗體。結果 患者的糞便標本腸道病毒總陽性率為82.26%（378/460），CVA16的陽性率為37.40%（172/460），EV71的陽性率為25.41%（116/460），其他腸道病毒為19.66%（90/460），CVA16行陽性率高于EV71。糞便標本的腸道病毒陽性率高于咽拭子的38.75%（345/549）（χ2=27.01，P<0.01）。發(fā)病年齡多為1～5歲，主要集中在3歲左右，男性患者多余女性患者。對手足口病病例的急性期血清進行酶免疫檢測，EV71和CVA16的陽性率分別為28.70%（31/108）和33.33%（36/108） ，和糞便標本的陽性率的核酸檢測比較，有較高的相關性。結論 2011～2013年度本市的手足口病疫情以腸道病毒通用型為主，糞便標本的陽性率較高，急性期血清的免疫實驗結果和分子生物系相符，采用分子生物學方法檢測手足口病的病原體，用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清抗體，對手足口病的診斷有重要作用。

關鍵詞：手足口病；腸道病毒；EV71；CA16

手足口?。?Hand-foot-and-mouth disease，HFMD） 是由多種腸道病毒（EV） 引起的常見傳染病，多發(fā)生于5歲以下兒童，大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，個別重癥患兒如果病情發(fā)展快，可導致死亡[1]，引起手足口病最常見病原為柯薩奇病毒A組16型（CVA16）和腸道病毒71型（ EV71），2007年北京市將手足口病納入全市傳染病常規(guī)報告系統(tǒng)，2008年5月2日起，手足口病納入我國丙類傳染病管理，北京市順義區(qū)自2006年初開始有手足口病例報告，近年來，HFMD發(fā)病率顯著升高，并呈現(xiàn)季節(jié)性流行和全年散發(fā)趨勢，現(xiàn)對2011～2013年北京市順義區(qū)手足口病病原學監(jiān)測數(shù)據(jù)進行分析，探索手足口病病原學特征，為手足口病防控工作提供科學依據(jù)[2]。

1 材料與方法

1.1標本采集對象的選擇和數(shù)量 標本采集對象為疫情出現(xiàn)時手足口病的臨床診斷病例。用于進行檢測的標本有糞便、咽拭子和血清。臨床標本在運輸和貯存過程中避免反復凍融，如果不能確保-20℃的條件，應該在 0～8℃運輸和保存。進入實驗室后，不能立即進行檢測的放置于-80℃冰柜中低溫保存，其中包括本地醫(yī)院臨床診斷為手足口病的患者糞便標本460份，咽拭子549份，血清108份。

1.2標本的種類及采集于運輸 糞便標本：采集患者發(fā)病7d內的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量為5～8g/份，采集后的糞便立即放入無菌采便管內，4℃暫時保存或者于12h內送到實驗室，-0℃以下低溫冷凍保存，若需要長期保存則將標本置于-80℃冰箱內。

咽拭子標本：采集患者發(fā)病3d內的咽拭子標本，用于病原檢測。用專用的棉簽采集，適度用力擦拭涂抹于咽后壁和兩側的扁桃體部位，應避免觸及舌部；然后迅速將棉簽放入裝有3mlHank’s保存液的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊封蓋并密封，以防止干燥。4℃暫存或12h內送入實驗室，-20℃以下低溫冷凍包藏，若需要長期保存則將標本置于-80℃冰箱。

血清標本：采集發(fā)病0～3d的急性期病例血清用于抗體檢測。靜脈采集3～5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清置于-20℃以下的冰箱中冷凍保存。

1.3主要試劑和儀器 檢測試劑采用中山大學達安基因公司制備的熒光法專用核酸檢測試劑盒。嚴格按照試劑盒說明書操作進行病毒RNA抽提，設計引物，應用abi7500熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR檢測。

1.4標本處理 在生物安全柜內，取5g左右的手足口病病例的糞便標本，放入50ml離心管，標記標本號，每管中加入10mlPBS、1g玻璃珠和1ml氯仿；用振蕩器劇烈振蕩40min；用冷凍離心機1500g離心20min；在生物安全柜中將每一份標本的上清液分別吸入2個帶螺旋蓋的凍存管中；一管糞便懸液凍存于-70℃作為備份，另一管用于病毒檢測和病毒培養(yǎng)。

咽拭子要在標本保存液中充分攪動或振蕩（至少40下） ，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒！然后在4℃條件下，10000r/min離心20min，用上清接種到細胞上或直接提取RNA。

1.5 Real time-PCR擴增 熒光定量PCR法的反應體系和反應參數(shù)依據(jù)試劑說明書操作。

1.6統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，應用χ2檢驗分析多個總體率或構成比之間差異有無統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1不同標本之間的檢測結果 2011～2013這3個年度的檢測結果，對手足口患者所采集的標本有糞便標本、咽拭子標本、血清標本三類。在糞便標本中，選擇合適的標本460份。其中，糞便和咽拭子兩類標本核酸檢測的腸道病毒陽性率分別為82.26%和37.40%，糞便標本的腸道病毒陽性率高于咽拭子的38.75%（345/549）（χ2=27.01，P<0.01），兩類標本的陽性率之間具有顯著性差異。急性期的血清標本采用ELISA檢測，雖然只能檢測EV71和CVA16，但陽性率較高（見表1）。

2.2 RT-PCR和Real time檢測結果

2.2.1手足口病的RT-PCR檢測結果10份標本的手足口病腸道病毒通用引物RT-PCR結果顯示，10份標本俊文陽性，基因擴增片段為116bp（圖1）。16份標本的手足口病腸道病毒EV71特異性引物的RT-PCR結果顯示，2、3、4、6、9、10、16號標本為陽性，基因擴增片段為226bp（如圖2）。在手足口病腸道病毒CVA16特異性引物的RT-PCR結果中顯示，除了8、9均為陽性，基因擴增片段為208bp（如圖3）。

圖1 手足口病腸道病毒通用引物RT-PCR結果

M：Marker，1～10：通用引物

圖2 手足口腸道病毒EV71特異性引物PT-PCR結果

M：marker，1～16：EV71：71：陰性對照，18：陽性

圖3 手足口病腸道病毒CVA16特異性引物RT-PCR結果

M：Maeker，1～10：CVA16，11：陽性對照

2.2.2手足口病的Real time-PCR檢測結果（如圖4）

3 討論

手足口病屬于全球傳染病，世界大部分地區(qū)均有手足口流行病的報道。我國于1981年開始在上海，以后北京、河北、福建等10多個省市先后都有報道。1999年夏季在廈門市流行的手足口病證實為EV71型引起。1985年香港出現(xiàn)EV71流行病，1987年湖北省也出現(xiàn) EV71流行病。1998年中國臺灣出現(xiàn)了歷史規(guī)模最大的手足口病大流行，診斷129106例，其中405個兒童為重癥病例，死亡78例[3]，2008年3月在安微，手足口病爆發(fā)是由EV71引起，同樣出現(xiàn)多例死亡病例[4]，EV71引起重癥感染的比例較大[5]，引起全社會的高度關注。2006、2007年，龍巖市均有手足口病散發(fā)的病例，實驗室檢測證實由 COXA16感染引起，患者病情較輕。2008年9月下旬，龍巖市手足口病爆發(fā)、流行，疫情波及全市各個縣（市、區(qū)），出現(xiàn)多例重癥病例，其中1例死亡。

手足口病的發(fā)病年齡多為1～5歲，主要集中在3歲左右，男性患者多余女性患者。對手足口病病例的急性期血清進行酶免疫檢測，EV71和CVA16的陽性率分別為28.70%（31/108）和33.33%（36/108），和糞便標本的陽性率的核酸檢測比較，有較高的相關性。2011～2013年度本市的手足口病疫情以CVA16為主，糞便標本的陽性率較高，急性期血清的免疫實驗結果和分子生物系相符，采用分子生物學方法檢測手足口病的病原體，用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清抗體，對手足口病的診斷有著重要作用，但是通常情況下，Cox A16引起的疾病預后相對較好，多為散發(fā)，極少導致手足口病的大規(guī)模暴發(fā)；而EV71型腸病毒則較兇險，除了引起手足口病以外，EV71較 Cox A16所致手足口病有更多機會可引起嚴重中樞神經系統(tǒng)并發(fā)癥。因此，在今后臨床中應注重?？刹《靖腥臼肿憧诓』颊叩姆乐喂ぷ?，尤其是EV71型患者，收治重點為早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免危重癥的發(fā)生。

在本研究結果中顯示的數(shù)據(jù)中可以看出，手足口病患者中多以EV、EV71型為主，說明在患者當中多以埃可病毒屬感染為主要病源，可能存在EV型和非EV71亞型協(xié)同感染；CoxA16僅僅占了很少數(shù)的比例。通過研究，我們可以為手足口病預防和控制提供更好的依據(jù)，更好的分析病因，掌握病毒病原體的流行特征，找出解決手足口病的辦法，更快的治療手足口病患者，使患者更早的脫離痛苦。以此，以減少手足口病的流行爆發(fā)、傳染，以及死亡病例的發(fā)生。

參考文獻：

[1]周世力，楊帆，金奇，等.腸道病毒71型的研究進展[J].病毒學報，2003.19（3）：284-286.

[2]崔愛利，許文波，李秀珠.腸道病毒71型的RT-PCR診斷及基因特征[J].病毒學報，2004，20（2）：16-165.

[3]楊秀惠，何家鑫，嚴延生，等.一起手足口病爆發(fā)的病原性診斷與分析[J].中國人獸共患病學報，2007，23（4）：323-326.

[4]馮云，張文宏.腸道V71型及其相關疾病研究進展[J].中華傳染病雜志，2008，26（7）：396-398.

[5]周方求，吳錦如，劉立志.PCR-熒光探針發(fā)對手足口病不同樣品病原學檢出率比較[J].實用預防醫(yī)學，2009，16（1）：259.

編輯/王敏