產(chǎn)高光學純度D—乳酸野生菌株的分離篩選

摘要：目的 從某發(fā)酵食品中分離篩選出產(chǎn)高光學純度D-乳酸的野生菌株。方法 用平板劃線法對某發(fā)酵食品中的野生菌株進行分離純化，用高壓液相色譜法測定所分離野生菌株發(fā)酵液中D-乳酸的光學純度，篩選出產(chǎn)高光學純度D-乳酸的菌株。結(jié)果 從某發(fā)酵食品中共分離篩選出9株野生菌株，產(chǎn)D-乳酸的光學純度達100%，將其命名為SZD菌株。結(jié)論 某發(fā)酵食品中存在產(chǎn)光學純度為100%D-乳酸的野生菌株。

關(guān)鍵詞：D-乳酸；棒狀乳桿菌；分離

右旋乳酸（D-乳酸）是一種重要的可降解的化工原料，由其單體聚合而成的聚乳酸可應用于手術(shù)縫合線、冠脈覆膜支架和骨折內(nèi)固定材料等[1]。生產(chǎn)乳酸大多采用發(fā)酵法，發(fā)酵法制備D-乳酸的主要技術(shù)瓶頸是缺乏產(chǎn)高光學純度（光學純度>97%）D-乳酸的菌株[2]。筆者在觀察某發(fā)酵食品原液抑菌活性的過程中意外發(fā)現(xiàn)此發(fā)酵食品原液中含有較高光學純度的D-乳酸。本研究擬從該發(fā)酵食品原液中分離篩選出產(chǎn)高光學純度D-乳酸的野生菌株。

1 資料與方法

1.1試劑 發(fā)酵食品原液采自陜西的一種發(fā)酵食品，該食品的細節(jié)因?qū)＠Ｗo的需要目前不便公開。MRS肉湯培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）。L-乳酸（色譜純，純度98%）及D-乳酸（色譜純，純度93%）均由美國西格瑪-奧德里奇公司出品。

1.2實驗儀器 Waters高效液相色譜儀2695（美國沃特世公司），waters紫外檢測器2489（美國沃特世公司）；色譜柱：型號為Chirex 3126（D）-penicillami的手性柱（美國菲羅門公司）。

1.3方法

1.3.1菌株的分離、純化 用滅菌接種環(huán)取發(fā)酵食品原液在MRS平板上三區(qū)劃線接種，35℃燭缸法培養(yǎng)48h后觀察菌落生長情況。用滅菌接種環(huán)從平板上選取菌落形態(tài)不同的菌落，分別采用三區(qū)劃線法接種于不同的MRS平板，35℃燭缸法培養(yǎng)48h，觀察每個平板菌落形態(tài)是否一致，重復以上操作直至每個平板上菌落形態(tài)一致。

1.3.2產(chǎn)高光學純度D-乳酸菌株的篩選 色譜條件：流動相：2mmol/L CuSO4溶液（溶劑為5%的異丙醇溶液），使用前經(jīng)0.45μm濾膜過濾；流動相流速為0.7mL/min；柱溫30℃；紫外檢測器，檢測波長為254 nm。

從分離純化后的菌株中選取G+桿菌，將其新鮮培養(yǎng)物接種于MRS液體培養(yǎng)基，35℃靜置培養(yǎng)48h。將發(fā)酵液12880×g離心15min，上清液用0.45μm濾膜過濾，取1mL濾液適當稀釋后超聲脫氣，即為待測液；將未接種細菌的MRS液體培養(yǎng)基經(jīng)同樣處理作為陰性對照。按上述色譜條件準備好色譜儀和流動相。將待測液樣品加入樣品瓶中，進樣量20μL，進樣時間30min。使用標準曲線法，根據(jù)已建立的標準曲線積分計算出待測液樣品中D-乳酸及L-乳酸的含量。從上述野生菌株中篩選出產(chǎn)高光學純度D-乳酸的菌株。

2 結(jié)果

共分離純化出26株產(chǎn)乳酸的G+桿菌，產(chǎn)D-乳酸的光學純度為58.19%～100%。其中有9株產(chǎn)D-乳酸的光學純度為100%，命名為SZD菌株，分別編號為：SZD-1、SZD-2、SZD-3、SZD-4、SZD-5、SZD-6、SZD-8、SZD-9、SZD-10。菌株SZD-2、SZD-5、SZD-9及SZD-10保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為：CGMCC No.6891～6894。見表1。

3 討論

發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸多采用乳酸菌，國內(nèi)外目前研究較多的D-乳酸發(fā)酵菌種主要集中于乳桿菌屬和芽孢乳桿菌屬。產(chǎn)D-乳酸的乳酸桿菌有棒狀乳桿菌扭曲亞種、德氏乳桿菌德氏亞種、德氏乳桿菌印度亞種、德氏乳桿菌乳酸亞種、德氏乳桿菌保加利亞亞種、美洲豹乳桿菌及詹氏乳桿菌等，產(chǎn)D-乳酸的芽孢乳桿菌有菊糖芽孢乳桿菌、納卡氏芽孢乳桿菌納卡亞種及土生芽孢乳桿菌等，但上述菌種中缺乏產(chǎn)高光學純度D-乳酸的野生菌株[3-5]。Manome等[6]對19種乳酸桿菌發(fā)酵葡萄糖所產(chǎn)D-乳酸的光學純度進行了檢測，其中產(chǎn)D-乳酸光學純度最高的為棒狀乳桿菌扭曲亞種（模式菌株NRIC 1051），D-乳酸光學純度為84.4%。Antonio等[7]用棒狀乳桿菌扭曲亞種（模式菌株DSM 20004）發(fā)酵葡萄糖，所產(chǎn)D-乳酸光學純度為93.2%～97.2%。丁子建等[8]用芽孢乳桿菌發(fā)酵葡萄糖，所產(chǎn)D-乳酸光學純度為96.04%。目前很少見到產(chǎn)D-乳酸光學純度為100%的野生菌株的文獻報道[9]，而我們從發(fā)酵食品中分離篩選出的9株SZD菌株產(chǎn)D-乳酸的光學純度達100%，用自制淀粉培養(yǎng)體系發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸濃度最高達57g/L，如將其應用于發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，將有助于提高D-乳酸的產(chǎn)能并降低生產(chǎn)成本。因此，SZD菌株具有很大的研究價值和廣闊的應用前景，我們已對這些菌株申報了國家發(fā)明專利。

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編輯/哈濤