摘要:目的 比較納米羥基磷灰石(nHA)配合富血小板纖維蛋白( PRF)與單獨(dú)使用納米羥基磷灰石,對犬牙槽突裂的修復(fù)效果。方法 選取12只健康成年犬, 采用自身對照的方法。在全麻下拔除狗的上頜左右側(cè)門齒,模仿人體牙槽突裂,制作一寬4mm,長5mm,深6mm的楔形骨缺損區(qū),關(guān)閉創(chuàng)口,喂養(yǎng)8w后,放入不同的填充材料,右側(cè)為實(shí)驗(yàn)組, 填充nHA與PRF混合物,左側(cè)為對照組,填充PRF,分別于4、8、12w處死動(dòng)物各4只, 獲取完整動(dòng)物標(biāo)本,行大體觀察及組織學(xué)染色檢查, 測量新生骨面積。結(jié)果 術(shù)后4、8、12w實(shí)驗(yàn)組新生骨面積大于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.05)。結(jié)論 nHA與PRF配合,有促進(jìn)牙槽突裂修復(fù)的作用。
關(guān)鍵詞:富血小板纖維蛋白;納米羥基磷灰石;牙槽突裂
牙槽突裂是唇裂畸形患者的常見并發(fā)癥,尤其是單側(cè)或雙側(cè)的完全性唇裂。修復(fù)牙槽突裂對于維持上頜骨連續(xù)性,促進(jìn)頜骨發(fā)育,誘導(dǎo)恒牙萌出,改善發(fā)音有重要意義。對于如何增加骨量,解決患者牙槽突裂,成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。因此,本實(shí)驗(yàn)建立狗的牙槽突裂模型,觀察不同的植入材料對牙槽突裂骨組織修復(fù)的效果,為臨床應(yīng)用提供可靠資料。
1 資料與方法
1.1一般資料 選擇健康雜種狗12只,無全身及口腔疾病,4~5個(gè)月齡,體重12~14kg,雌雄不分,隨機(jī)分為三組,每組4只。
1.2試劑和器材 納米羥基磷灰石(遵義醫(yī)學(xué)院材料中心提供,孔隙率80% ,孔徑100~500μm)、BI2000 型圖像分析系統(tǒng)(中國四川) 等。
1.3方法
1.3.1 PRF的制備 采用一次離心的方法, 手術(shù)前用真空采血管采血15mL,立即在離心機(jī)上以3000r/min離心10min,得到上層的乏血小板血漿(platelet poor plasma, PPP),中間層的PRF與下層的紅細(xì)胞。棄掉上層液體,得到淡黃色凝膠狀PRF,用剪刀剪成1×2mm大小顆粒狀,與nHA按1:1比例混勻,備用。
1.3.2實(shí)驗(yàn)方法 犬全身麻醉、側(cè)臥固定、保持張口度,常規(guī)消毒、鋪巾。牙齦分離器分離犬上頜左右側(cè)門齒的牙齦,小心拔除。用高速渦輪機(jī)在拔牙窩處制作一寬4mm,長5mm,深6mm的楔形骨缺損區(qū),建立牙槽突裂動(dòng)物模型,關(guān)閉創(chuàng)口,喂養(yǎng)8w,再次手術(shù),打開后放入不同的填充材料,右側(cè)為實(shí)驗(yàn)組, 填充nHA與PRF混合物,左側(cè)為對照組,填充PRF,術(shù)后青霉素肌注3d預(yù)防感染。分別于4、8、12w處死動(dòng)物各4只, 獲取完整動(dòng)物標(biāo)本,行大體觀察及組織學(xué)染色檢查, 測量新生骨面積。
1.4觀察指標(biāo)
1.4.1組織學(xué)檢查 在距種植體周骨缺損區(qū) 5mm處取材,經(jīng)10%福爾馬林固定, 50mL/L硝酸脫鈣, 梯度酒精、丙酮脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,HE染色,光鏡觀察。
1.4.2新生骨定量分析 在每組各個(gè)時(shí)間段的同一部位隨機(jī)取3張組織學(xué)切片, 在光學(xué)顯微鏡下(*100)觀察新生骨生成情況, 采集圖像,導(dǎo)入計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng), 每張切片采集上下左右及中心區(qū)共5 個(gè)視野, 測量每個(gè)視野下新生骨組織面積,計(jì)算與缺損重建區(qū)總面積的百分比,結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 組織形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)采用 SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 用配對 t檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)組與對照組結(jié)果進(jìn)行處理,計(jì)量資料以(x±s)表示,P<0.05表示有顯著差異。
2 結(jié)果
2.1大體觀察 所有犬均無死亡或炎性反應(yīng)等并發(fā)癥發(fā)生。傷口愈合好,隨著時(shí)間的延長,牙槽嵴裂凹陷逐漸減小,同一時(shí)期中,實(shí)驗(yàn)組傷口愈合比對照組更平實(shí)。
2.2組織學(xué)觀察 術(shù)后4w時(shí),犬牙槽嵴裂處新骨開始生成, 實(shí)驗(yàn)組大立方形成骨細(xì)胞覆蓋在已經(jīng)形成的類骨質(zhì)周圍,有大量成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管,少量淋巴細(xì)胞、破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,新生骨呈條索狀;對照組與之相似, 但纖維成分多、細(xì)胞成分少、毛細(xì)血管稀疏, 新生骨少,呈點(diǎn)狀分布。術(shù)后8w時(shí),犬牙槽嵴裂處新骨形成活躍,實(shí)驗(yàn)組新生骨粗大致密, 融合成網(wǎng)狀, 成骨細(xì)胞及血管依然較多,對照組成骨細(xì)胞及血管較少,新生骨稀疏較,排列不規(guī)則。術(shù)后12w犬牙槽嵴裂處的成骨細(xì)胞開始變?yōu)樾?,成為骨?xì)胞,陷入骨基質(zhì)中,新生骨開始礦化成熟,實(shí)驗(yàn)組骨基質(zhì)中骨細(xì)胞多而致密,新生骨融合成片,板狀骨開始出現(xiàn);對照組的骨基質(zhì)中骨細(xì)胞少,新生骨面積較小、分布不均,板狀骨少見。
2.3新生骨定量分析 術(shù)后4、8、12w實(shí)驗(yàn)組新生骨面積百分比大于對照組, 兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表 1。
3 討論
修復(fù)牙槽突裂的骨移植材料,常用的有自體骨、異體骨、人工骨等。自體骨有不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng),臨床效果好,是移植材料的\"金標(biāo)準(zhǔn)\",但是常常有獲取量有限,塑性困難等缺點(diǎn),患者也同時(shí)要忍受供骨區(qū)的手術(shù),感染及并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)[1]。異體骨則是尸體取骨或哺乳動(dòng)物的骨無機(jī)化處理的產(chǎn)物,這類材料的優(yōu)點(diǎn)在于來源于哺乳動(dòng)物本身,生物相容性好,無排斥反應(yīng)及抗原性,不傳播疾病等;缺點(diǎn)是生物降解不易調(diào)控,加工困難,來源有限,價(jià)格昂貴,吸收時(shí)間不確定等,應(yīng)用受到一定限制[2]。人工材料有納米羥基磷灰石、磷酸三鈣等,這類材料克服了異體骨的缺點(diǎn),具有可塑性高、吸收穩(wěn)定、加工容易、可按需要調(diào)整孔隙大小、價(jià)格便宜等特點(diǎn),同時(shí)納米羥基磷灰石還具有以下特性:有良好的生物相容性,無毒無害,能在短時(shí)間內(nèi)與機(jī)體軟硬組織緊密結(jié)合;在形態(tài)、晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度上與人體骨組織和牙組織的磷灰石相似,有類似的物理化學(xué)性質(zhì),在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮對牙槽骨裂隙區(qū)的支撐作用;有良好的可降解性,其孔隙率達(dá)80%~90%,6個(gè)月降解率為80%[3],本實(shí)驗(yàn)中,nHA恰好在骨形成穩(wěn)定時(shí),達(dá)到大部分的降解,但它缺乏骨誘導(dǎo)性。
理想的牙槽突裂修復(fù)材料除了需要具有在一定時(shí)間內(nèi)的可吸收性和生物相容性外,還需要有良好的骨誘導(dǎo)性。富血小板纖維蛋白(PRF)是具有立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的纖維蛋白,含豐富的血小板和多種生長因子,其與富血小板血漿(PRP)相比,最大的優(yōu)勢在于制作方法更為簡便,僅僅需要一次離心;不需要添加任何抗凝劑和激活劑,更為安全,影響因素更少,同時(shí)還有以下特性: PRF含有大量未充分激活的含有Q顆粒的血小板。 PRF的蛋白立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以與血小板形成的生理性結(jié)合,可以相對延長生長因子的作用時(shí)間。 PRF內(nèi)存在的高濃度的白細(xì)胞,有利于減少術(shù)后腫脹和疼痛。因此,PRF具有骨誘導(dǎo)性,但其單獨(dú)使用時(shí)吸收速度偏快,且彈性膜的量較天然骨低。
本研究通過nHA與PRF聯(lián)合使用,充分發(fā)揮兩種材料的特性,觀察其成骨效果。術(shù)后4w時(shí),PRF的生長因子促進(jìn)了細(xì)胞的增殖分化,nHA/PRF組的成骨細(xì)胞及新生骨組織比nHA組更多;術(shù)后8w時(shí),PRF的纖維蛋白柔韌多孔的三維空間結(jié)構(gòu)為組織細(xì)胞的遷徙、增殖、分化提供了有利的場所,也更有利于毛細(xì)血管的長入及穩(wěn)定,因此實(shí)驗(yàn)組有更強(qiáng)的成骨能力;術(shù)后12w,PRF利于間充質(zhì)干細(xì)胞的遷入、粘附和分化及骨細(xì)胞的形成,所以,nHA/PRF組的新骨形成的量及成熟度均高于nHA組。因此,nHA/PRF復(fù)合物分別在術(shù)后 4、8、12w獲得良好的成骨效果,是良好的牙槽突裂修復(fù)材料,但其具體的作用機(jī)制還需要更深入的研究。
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