胰腺癌干細(xì)胞分離與耐藥的研究

摘要：目的 引入流式細(xì)胞術(shù)SP細(xì)胞分選法分離胰腺癌CSC，探索CSC在腺癌耐藥中的作用。方法 流式細(xì)胞術(shù)SP細(xì)胞分選法分離胰腺癌PANC-1的SP細(xì)胞，吉西他濱干預(yù)SP和non-SP細(xì)胞，抑制實驗檢測藥物敏感性，流式細(xì)胞術(shù)檢測SP比例變化。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)SP細(xì)胞分選法能夠從PANC-1中分離出SP細(xì)胞，SP細(xì)胞對吉西他濱的抑制增殖作用有較強(qiáng)的耐受性，吉西他濱干預(yù)后SP細(xì)胞比例上調(diào)。結(jié)論 胰腺癌SP細(xì)胞具有胰腺癌CSC的惡性生物學(xué)特征，CSC是胰腺癌耐藥的根源。

關(guān)鍵詞：胰腺癌；SP細(xì)胞；CSC；耐藥

胰腺癌預(yù)后差，5年生存率不足5%，中位生存期僅6個月[1]，胰腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的機(jī)理復(fù)雜，容易對化療藥產(chǎn)生耐藥性是主要原因之一[2]，因此研究胰腺癌的耐藥機(jī)制尤為必要。腫瘤干細(xì)胞（Cancerstemcells，CSC）學(xué)說認(rèn)為惡性腫瘤中存在極少數(shù)具有成體干細(xì)胞特征的細(xì)胞亞群，是惡性腫瘤耐化療藥物的根源[2]。本研究引入流式細(xì)胞術(shù)SP細(xì)胞分選法分離胰腺癌CSC，初步探索CSC在胰腺癌耐藥中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料 人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1購自上海中科院細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司、胎牛血清購自美國Hyclone公司、胰蛋白酶購自美國Mediatec公司，Hoechest33342購自美國Sigma公司，Verapamil購自美國Sigma公司，吉西他濱（健擇，Gemzar）購自美國Lilly公司，超凈臺購自AIRTECH公司，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自NAPACO5410，Zseries細(xì)胞計數(shù)儀購自美國貝克曼公司，流式細(xì)胞儀購自美國Morflow，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，Western-blot轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司，水浴槽購自江蘇常熟醫(yī)療器械廠。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與觀察 采用體外細(xì)胞培養(yǎng)對人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1進(jìn)行傳代與培養(yǎng)，培養(yǎng)條件嚴(yán)格按照ATCC推薦條件執(zhí)行；24孔板細(xì)胞計數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線，Zseries細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，獲得實驗數(shù)據(jù)。

1.2.2CSC的分離與鑒定 采用流式細(xì)胞術(shù)SP分選法，分離并鑒定PANC-1的SP細(xì)胞亞群具有CSC特性。

1.2.3胰腺癌干細(xì)胞對吉西他濱的耐受性檢測 吉西他濱干預(yù)SP細(xì)胞亞群和non-SP細(xì)胞亞群，比較兩細(xì)胞亞群耐受吉西他濱的差異；進(jìn)而檢測吉西他濱干預(yù)PANC-1后SP細(xì)胞比例。

2結(jié)果

2.1吉西他濱抑制濃度測定 見圖1。

圖1 吉西他濱抑制曲線

PANC-1細(xì)胞系用0.1～100uM濃度的吉西他濱處理72h，結(jié)果顯示：0.1μM吉西他濱處理72h，細(xì)胞的增殖活力急遽下降，到吉西他濱1μM的時候，細(xì)胞增殖活力基本達(dá)到了最大抑制。結(jié)合文獻(xiàn)報道，本課題選用1μM濃度和10μM濃度作為吉西他濱干預(yù)PANC-1的SP細(xì)胞亞群和non-SP細(xì)胞亞群的實驗濃度，以探討兩亞群對吉西他濱的敏感性。

2.2人胰腺癌細(xì)胞SP細(xì)胞對吉西他濱作用不敏感 見表1，1μM吉西他濱作用PANC-1的SP細(xì)胞72h后，平均活細(xì)胞數(shù)是39346.7，未分選的PANC-1活細(xì)胞數(shù)是6463.3，而non-SP活細(xì)胞數(shù)是496.0（P<0.05），同樣的結(jié)果在10μM吉西他濱被發(fā)現(xiàn)（P<0.05）。表明吉西他濱對SP細(xì)胞亞群的增殖活性抑制作用較弱；吉西他濱對non-SP細(xì)胞亞群的增殖活性抑制作用較強(qiáng)，SP細(xì)胞增殖對吉西他濱的藥理作用有耐受性。

2.3吉西他濱誘導(dǎo)PANC-1后SP細(xì)胞比例增加 見圖2。

圖2A

圖2B

圖2 吉西他濱干預(yù)PANC-1后SP細(xì)胞比例升高

吉西他濱干預(yù)PANC-1細(xì)胞后，檢測到對Velapamil敏感的SP細(xì)胞，其比例升高（圖2B），由8.74%±0.33%升高至22.67%±3.21%（圖3A），具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。提示具有胰腺癌干細(xì)胞特性的SP細(xì)胞對吉西他濱耐受性較強(qiáng)，non-SP細(xì)胞對吉西他濱耐受性較弱，吉西他濱處理后SP細(xì)胞存活下來，增加的SP細(xì)胞可能大多數(shù)就是胰腺癌干細(xì)胞，也間接反應(yīng)SP細(xì)胞具有胰腺癌CSC特性。

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)SP（Sidepopulation）分選法利用干細(xì)胞對Hoechest33342拒染的原理，分離出具有干細(xì)胞特性的SP細(xì)胞，SP細(xì)胞在許多腫瘤領(lǐng)域被證實具有腫瘤干細(xì)胞特性[3]。獲得高純度的腫瘤干細(xì)胞是CSC研究的基礎(chǔ)，胰腺癌缺乏公認(rèn)CSC表面標(biāo)志物，SP分選法為胰腺癌CSC分離鑒定提供了新的思路。本課題組研究[4]發(fā)現(xiàn)人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1存在Verapamil敏感的SP細(xì)胞，含量8.74%±0.33%；加入維拉帕米后SP細(xì)胞降低90%左右，數(shù)量明顯減少，證實人胰腺癌細(xì)胞系中確實存在SP細(xì)胞亞群存在。本課題組通過平板克隆實驗、細(xì)胞分化實驗、裸鼠成瘤實驗、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期、Transwell法檢測侵襲和遷移能力檢測胰腺癌細(xì)胞SP細(xì)胞亞群和non-SP細(xì)胞亞群生物學(xué)功能差別，顯示SP細(xì)胞亞群具有更強(qiáng)的自我更新和增殖分化能力，證實SP細(xì)胞符合腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的特點[4]。

胰腺癌SP細(xì)胞是否對化療藥物有較強(qiáng)的耐受性，需要進(jìn)一步研究。吉西他濱的出現(xiàn)標(biāo)志著胰腺癌的藥物治療取得顯著的進(jìn)步，被證實為第一個能有效緩解胰腺癌癥狀和改善預(yù)后的抗癌藥物，是中晚期胰腺癌和胰腺癌術(shù)后的標(biāo)準(zhǔn)治療[5]。本課題用0.1～100μM濃度的吉西他濱處理PANC-1細(xì)胞72h，活細(xì)胞計數(shù)法檢測不同濃度吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果表明0.1μM吉西他濱能夠?qū)ANC-1細(xì)胞的增殖活性有明顯抑制作用，吉西他濱是治療胰腺癌的有效藥物[5]。

許多接受吉西他濱治療的胰腺癌患者在承受了化療毒副作用的同時，沒有得到較好的治療效果，本課題結(jié)果也顯示吉西他濱處理胰腺癌細(xì)胞系后，仍然有殘存細(xì)胞，提示胰腺癌的內(nèi)在的或（和）獲得性的耐藥性是影響胰腺癌化療效果的主要原因[5]。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說為惡性腫瘤多藥耐藥特性的研究提供了重要理論基礎(chǔ)，實驗提示該亞群對化療藥物耐受，治療后該亞群細(xì)胞的豐度還有可能提高，導(dǎo)致殘留惡性腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的增加，這一現(xiàn)象在一些實體腫瘤中得到了證實[5]。

在胰腺癌領(lǐng)域，Hermann等[6]發(fā)現(xiàn)長期吉西他濱治療使CD133+胰腺癌干細(xì)胞的比例增加，CD133+細(xì)胞具有明顯的耐藥性，延長干預(yù)時間到5d后，胰腺癌細(xì)胞中CSC的比例反而增加至50%；加大藥物劑量后也不能完全殺死CD133+細(xì)胞。隨后研究[7，8]也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用放療和吉西他濱干預(yù)人胰腺癌組織異種移植瘤模型后，反而使CD44+CD24+ESA+的胰腺癌CSC比例增加；應(yīng)用治療劑量吉西他濱干預(yù)胰腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)選擇性生長，耐藥細(xì)胞中CSC細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)呈上升趨勢。這些研究以胰腺癌表面標(biāo)志物分離CSC，胰腺癌CSC目前還沒有公認(rèn)的特異性表面標(biāo)志物，也使胰腺癌CSC耐藥機(jī)制受到質(zhì)疑。

為深入探討胰腺癌CSC和耐藥機(jī)制，本課題通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期顯示SP細(xì)胞較non-SP胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，符合干細(xì)胞特殊生物學(xué)特性--CSC通常處于靜態(tài)[4]，多數(shù)抗腫瘤藥物都通過抑制DNA合成或腫瘤細(xì)胞分裂，抑制腫瘤細(xì)胞生長，腫瘤細(xì)胞須有積極分裂才能對抗腫瘤藥物敏感，化療只是引起非CSC被殺死，靜態(tài)的CSC在化療后大多數(shù)生存下來[9]，導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示PANC-1的SP細(xì)胞和non-SP細(xì)胞亞群的細(xì)胞增殖能力對吉西他濱的敏感性有明顯差異，SP細(xì)胞較non-SP細(xì)胞對吉西他濱耐受性強(qiáng)，有效劑量的吉西他濱干預(yù)后SP細(xì)胞能夠繼續(xù)增殖，且增殖能力遠(yuǎn)高于non-SP細(xì)胞；提示SP細(xì)胞能夠耐受吉西他濱的抑制細(xì)胞復(fù)制的藥理作用。

進(jìn)一步結(jié)果顯示吉西他濱干預(yù)后胰腺癌細(xì)胞系SP細(xì)胞含量提高，進(jìn)一步證實SP細(xì)胞對吉西他濱耐受性較強(qiáng)；對吉西他濱不敏感的SP細(xì)胞存活下來，提示PANC-1的SP細(xì)胞亞群對吉西他濱不僅不敏感，吉西他濱干預(yù)可以提高SP細(xì)胞的豐度，導(dǎo)致殘留胰腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的增加。

細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)及耐受化療藥物是CSC的基本生物學(xué)特征[4]，人胰腺癌PANC-1的SP細(xì)胞亞群具有胰腺癌CSC特性，流式細(xì)胞術(shù)SP分選法能夠分離CSC和非CSC亞群，有效劑量的吉西他濱干預(yù)后CSC能夠繼續(xù)增殖，且增殖能力遠(yuǎn)高于非CSC，提示胰腺癌CSC較非CSC對吉西他濱耐受性強(qiáng)，CSC能夠耐受吉西他濱的抑制細(xì)胞復(fù)制的藥理作用，胰腺癌干細(xì)胞是胰腺癌細(xì)胞耐藥的根源：要治愈胰腺癌必須殺滅胰腺癌CSC，而要殺滅胰腺癌CSC就必須繼續(xù)闡明其惡性分子生物學(xué)機(jī)制，找到其靶向性的治療位點[10]。

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編輯/王海靜