異丁醇生物合成的研究進(jìn)展

田宇 王義強(qiáng) 王啟業(yè)

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410004）

目前，石油、煤炭及天然氣等化石燃料在價格不斷上漲的同時，正面臨資源枯竭的危險［1]。發(fā)展生物燃料已成為許多國家提高能源安全、減排溫室氣體、 應(yīng)對氣候變化的重要措施。當(dāng)前市場上的生物燃料以燃料乙醇和生物柴油最為常見，異丁醇與這些生物燃料相比具有高能量密度和低吸濕性等優(yōu)勢，因此被作為一種補(bǔ)充或替代汽油的新型生物燃料加以重點(diǎn)研究。除作為生物燃料外，異丁醇也是合成增塑劑、防老劑、人工麝香、果子精油和藥物的重要原料，還是生產(chǎn)涂料、清漆的重要配料，并可作為正丁醇的代用品。異丁醇還可以脫水生成具有更高價值的異丁烯，作為塑膠及柴油機(jī)燃料的原料［2]。因此，異丁醇的研究開發(fā)日益受到許多國家的重視。

1 異丁醇生產(chǎn)技術(shù)與現(xiàn)狀

長久以來，異丁醇作為重要的中間物質(zhì)被用于食品、醫(yī)藥和化工等多個行業(yè)［3]。作為新型生物燃料，異丁醇有其獨(dú)特的優(yōu)勢，更具有廣闊的發(fā)展前景。異丁醇具有不易吸水、揮發(fā)性低等特點(diǎn)，異丁醇的運(yùn)輸可以直接利用現(xiàn)有的汽油輸送管道及分銷渠道，且異丁醇對汽車引擎造成的損傷更小，現(xiàn)有汽車引擎可直接使用，不需要摻入汽油，同時與生產(chǎn)1 gal的乙醇相比，生產(chǎn)1 gal的異丁醇所需要消耗的能量更少，且能多生產(chǎn)至少50%的可用能源［4]。異丁醇代替生物乙醇作為汽車燃料有很大的可能性［5]。

目前生產(chǎn)異丁醇主要分成化學(xué)合成法和生物合成法兩大類，其中化學(xué)合成法占主導(dǎo)地位?；瘜W(xué)合成法主要有以下3種方法：（1）丙烯羰基合成法［6]是在由丙烯和合成氣制取正丁醇和2-乙基己醇工業(yè)中副產(chǎn)異丁醛經(jīng)加氫制得；（2）合成氣在Cu-Mg催化劑作用下合成甲醇中得到異丁醇［7]；（3）由Zn-Cr氧化物催化劑低碳醇生產(chǎn)異丁醇［8]。目前，世界上主要還是通過是丙烯羰基合成法生產(chǎn)異丁醇?；瘜W(xué)方法合成的異丁醇工藝繁瑣，催化劑價格高。同時，隨著近年來石油價格的高漲與持續(xù)減少和異丁醇需求的增長，再加之羰基合成醇裝置的盈利利潤不高，一些歐洲生產(chǎn)商關(guān)停部分裝置，而轉(zhuǎn)向其他產(chǎn)品發(fā)展，使得異丁醇供應(yīng)形勢十分緊張。雖然幾年來，國內(nèi)的羰基醇裝置的建成和調(diào)整裝置，使異丁醇供需矛盾將有一定改善，但是由于生產(chǎn)異丁醇原料的嚴(yán)重不足和催化劑價格昂貴，導(dǎo)致異丁醇供應(yīng)不能滿足當(dāng)前的需要，市場缺口仍然很大。生產(chǎn)異丁醇的原料供應(yīng)對化學(xué)法大量合成異丁醇形成了嚴(yán)重制約，并且在合成過程中造成的嚴(yán)重環(huán)境問題，使人們不得不尋找新的異丁醇合成方法，同時更加意識到生物合成異丁醇具有良好的發(fā)展前景。

但生物合成法生產(chǎn)的異丁醇主要是通過糧食發(fā)酵生產(chǎn)正丁醇中的少量副產(chǎn)。因此，利用生物合成法直接發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇被視為未來發(fā)展的重要方向［9]。

2 異丁醇生物合成研究現(xiàn)狀

燃料乙醇和丁醇已經(jīng)通過釀酒酵母和丙酮丁醇羧菌發(fā)酵生產(chǎn)達(dá)到了工業(yè)化的程度［10，11]，而到目前為止，一直沒有發(fā)現(xiàn)有原始菌株可以直接合成異丁醇。1998年，Dickinson等［12]研究了釀酒酵母中纈氨酸代謝途徑中異丁醇的合成途徑，但其是把它作為纈氨酸代謝的微量副產(chǎn)物，不能達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。 就目前的市場而言，如果要使發(fā)酵法生產(chǎn)異丁醇在工業(yè)化方面較化學(xué)法更具有競爭力，發(fā)酵法必須擁有短時間內(nèi)達(dá)到較高產(chǎn)量和成本較低的特點(diǎn)。傳統(tǒng)的發(fā)酵菌株不能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，因此我們需要對異丁醇生產(chǎn)的宿主菌株進(jìn)行改造，提高其對產(chǎn)物的耐受力、原料利用率等性狀［13]。2008年Atsumi等［14]利用代謝工程手段對大腸桿菌進(jìn)行了改造，使其能夠利用葡萄糖生產(chǎn)異丁醇，為構(gòu)建高產(chǎn)異丁醇基因工程菌提供了新的思路，開啟了生物合成異丁醇的大門。目前用于合成異丁醇研究的菌株主要有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母等。下面對這幾種菌的基因工程改造、生物合成異丁醇的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2.1 大腸桿菌（Escherichia coli）生物合成異丁醇

E. coli培養(yǎng)條件簡單，生長迅速，底物范圍廣，可發(fā)酵戊糖和己糖，有工業(yè)化生產(chǎn)的先例（生產(chǎn)重組蛋白），并且傳統(tǒng)醇類（如燃料乙醇）發(fā)酵也以大腸桿菌工程菌進(jìn)行。2008年，Atsumi等［14]發(fā)表在Nature雜志上的文章表明，異丁醇的生物合成途徑是：在2-酮酸脫羧酶（kivd）作用下，前體物質(zhì)2-酮異戊酸脫羧生成為異丁醛，然后由乙醇脫氫酶（Adh2）將異丁醛還原為異丁醇。在啟動子PLlacol的作用下過度表達(dá)ilvHCD基因和敲出在合成異丁醇途徑中產(chǎn)生的副產(chǎn)物的adhE、dhA、frdAB、pflB、fnr和pta等基因，然后用轉(zhuǎn)移性更高的枯草芽孢桿菌的alsS基因替換活性較低的ilvH基因。經(jīng)此改造后的工程菌，發(fā)酵110 h后異丁醇的產(chǎn)量可高達(dá)22 g/L，相當(dāng)于理論值的86%。2009年，Potera［2]在發(fā)表的文章中闡述了美國杜邦公司已運(yùn)用此方法生產(chǎn)異丁醇。2010年，郭媛等［15]將釀酒酵母菌株中的2-酮酸脫酸酶基因（aro10）及乙醇脫氫酶基因（Adh2）導(dǎo)入工程菌，同時缺陷pflB、frdAB和fnr等3個基因，成功構(gòu)建了可以利用蔗渣生產(chǎn)異丁醇的工程菌菌株。同年，Ekaterina 等［16]成功將乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸同分異構(gòu)體還原酶（ilvC）、二羥酸脫羧酶（ilvD）、2-酮酸脫酸酶（kivd）和乙醇脫氫酶（Adh2）等基因引入大腸桿菌，構(gòu)建了工程菌，結(jié)果表明，該工程菌可以利用葡萄糖產(chǎn)生異丁醇，在有氧條件下異丁醇產(chǎn)量到達(dá)1.5%。2011年，林麗華等［17]將2-酮酸脫羧酶基因（kdcA） 克隆到大腸桿菌缺失型突變株BW25113 中，將這些相關(guān)基因串聯(lián)在一個質(zhì)粒中表達(dá)，發(fā)酵24 h，產(chǎn)率達(dá)到3 g/L。該研究組進(jìn)一步將大腸桿菌缺失型突變株BW25113中的pflB、frdAB、fnr和Adh2四個基因敲除，得到工程菌異丁醇產(chǎn)量提高了40%，達(dá)到了4.2 g/L［18]。2008年，Atsumi等［14]在大腸桿菌中將幾種不同的脫羧酶的編碼基因進(jìn)行了比較，包括來自S. cerevisae的aro10、pdc6和thi3，來自L. lactis的kivd和來自C.aectobutylicum的pdc等。研究結(jié)果表明，在異丁醇的合成過程中，kivd編碼的脫羧酶活性最高。 2010年，Atsumi等［19]對比了L. lactis中adhA、S. cerevisae中的Adh2中和E. coil中yqhD三個基因在大腸桿菌中的活性，研究表明adhA在大腸桿菌中呈現(xiàn)的異丁醛還原酶的活性最大，所以adhA更適合作為大腸桿菌中還原合成異丁醇的基因。Smith等［20]利用NTG作為誘變劑，對產(chǎn)異丁醇的E. coli JCL16進(jìn)行誘變篩選，獲得了一株產(chǎn)量達(dá)到590 mg/L異丁醇的菌株NV1和產(chǎn)量為4.1 g/L的NV2，進(jìn)一步對NV2進(jìn)行誘變的得到產(chǎn)量為6.1 g/L的NV3。Bastian等［21]利用定點(diǎn)突變的手段，將E. coil異丁醇合成菌株中的酮酸還原異構(gòu)酶ilvC與乙醇脫氫酶adhA分別突變，得到的改造菌株E. coilpGVferm6，該菌株在厭氧條件下異丁醇的合成量達(dá)到了13.4 g/L，相對原菌種E. coilpGVferm2（2.3 g/L）提高了5.8倍。Thrih等［22]通過研究E. coli合成異丁醇的碳代謝途徑，確定了合理的敲除途徑，獲得了能在厭氧條件下合成異丁醇的E. coli。2012年，潘超強(qiáng)等［23]通過改造僅將kivd和Adh2串聯(lián)克隆到E. coli中，24 h后異丁醇的生物合成量就達(dá)到0.12 g/L。

2.2 枯草芽孢桿菌生物合成異丁醇

隨著枯草芽孢桿菌基因圖譜的繪制完成，Bacillus subtilis已被作為基因改造和工程菌構(gòu)建的重要菌株。2008年，F(xiàn)ischer等［13]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的對正丁醇的耐受性較好（異丁醇毒性與其相似），在2.0%正丁醇存在時其生長速率約為大腸桿菌的8倍。與此同時，枯草芽孢桿菌中的alsS基因是對編碼對丙酮酸有高度專一性的乙酰乳酸合酶的優(yōu)勢基因?；谝陨蠋c(diǎn)優(yōu)勢，枯草芽孢桿菌也被作為生物合成異丁醇的改造菌株。

2010年，謝夏等［24]將Adh2（S. cerevisae）和kivd（L. lactis）連接到載體上，由p43啟動子啟動兩個基因表達(dá)構(gòu)建重組載體，再導(dǎo)入B. subtilis168中，獲得重組菌。然后，通過對重組菌發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明在發(fā)酵35 h后，異丁醇產(chǎn)量為0.607 g/L。2011年，Li等［25]將外源的乙酰羥酸合成酶基因、乙酰羥酸同分異構(gòu)體還原酶基因（ilvC）、二羥酸脫羧酶基因（ilvD）、2 -酮酸脫羧酶基因（kivd）和乙醇脫氫酶基因（Adh2）等5個基因引入枯草芽孢桿菌，過度表達(dá)乙酰羥酸合成酶基因，異丁醇的產(chǎn)率提高2.8倍。工程菌B. subtilis在微氧條件下發(fā)酵，得到的異丁醇產(chǎn)量為2.62 g/L 。Li等［26]構(gòu)建了B. subtilis異丁醇合成菌的基因組尺度代謝網(wǎng)絡(luò)模型，該菌株在好氧-微氧雙階段條件下培養(yǎng)，異丁醇產(chǎn)量達(dá)到5.5 g/L，較原來菌株異丁醇生物合成量提高了70%。

2.3 其他菌株生物合成異丁醇

除上述幾種菌種外，釀酒酵母和谷氨酸桿菌等也有發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇的報道。早在1998年，Dickinson等［12]的研究結(jié)果，表明釀酒酵母內(nèi)能夠通過纈氨酸代謝途徑合成異丁醇，但產(chǎn)率不高。Chen等［27]研究表明，釀酒酵母厭氧發(fā)酵情況，通過過度表達(dá)基因ILV2、ILV3和ILV5，使異丁醇的產(chǎn)量從0.16 mg/g葡萄糖提高到0.97 mg/g葡萄糖。通過BAT2的過度表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)支鏈氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移酶則可使異丁醇產(chǎn)量進(jìn)一步提高兩倍。Krause等［28]通過失活C. glutamicum菌株中丙酮酸退青梅復(fù)合體（PDHC）、苯醌氧化還原酶與氨基轉(zhuǎn)移酶，培養(yǎng)72 h后該菌株kivd生物合成量有明顯提高。同時，2011年，張路路等［29]研究結(jié)果表明，釀酒酵母耐受丁醇的特性遠(yuǎn)優(yōu)于原核生物，耐受濃度達(dá)到16 g/L，由此可以看出釀酒酵母很適合作為生物合成異丁醇的宿主菌株。

2010年，Smith等［30]將alsS（Bacillus subtilis）、Adh2、ilvC、ilvD（C. glutamicum）和kivd（Lactococcus lactis）導(dǎo)入谷氨酸棒桿菌中并且過度表達(dá)，在適合的條件下分批培養(yǎng)發(fā)酵120 h后，異丁醇產(chǎn)率達(dá)到了4.9 g/L。Blombach等［31]以缺陷型C. glutamicum為宿主，失活LDH與蘋果酸脫氫酶并過度表達(dá)E.coli轉(zhuǎn)氫酶PntAB后，菌株在好氧-厭氧雙階段條件下，進(jìn)行分批-補(bǔ)料發(fā)酵異丁醇產(chǎn)量提高到13 g/L。

2009年，Atsumi等［32]對細(xì)長集球藻菌進(jìn)行了基因改造，將酮酸脫羧酶（kivd）基因、alsS基因和來自大腸桿菌的ilvC和ilvD等基因過度表達(dá)，在菌液中檢測到異丁醇量為0.4 g/L。通過光合作用，轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻就可以產(chǎn)生異丁醇。2010年，美國杜邦公司和其合作伙伴 BioArchitecture Lab 獲得美國國家資助進(jìn)行綠藻水產(chǎn)養(yǎng)殖，綠藻轉(zhuǎn)化成可利用的糖，將糖轉(zhuǎn)化為異丁醇的工藝研究。

2011年，Higashide等［33]利用基因改造手段將一株從腐爛的草中分離處能直接利用纖維素的梭菌C. cellulolyticum，該工程菌可以直接利用纖維素合成異丁醇，8 d左右異丁醇產(chǎn)量已達(dá)到660 mg/L。

3 小結(jié)

隨著石油化工的快速發(fā)展和化學(xué)法合成異丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)，使得生物合成異丁醇產(chǎn)品缺乏經(jīng)濟(jì)競爭力。主要有兩方面原因：一是生物合成異丁醇產(chǎn)量低，由于工程菌的2-酮酸脫羧酶的表達(dá)量低直接導(dǎo)致異丁醇量低，異源代謝產(chǎn)物及中間產(chǎn)物的積累可能會導(dǎo)致細(xì)胞毒性反應(yīng)影響產(chǎn)率，還有乙醇等的生物合成代謝途徑也會降低產(chǎn)率；二是目前的生物異丁醇的合成主要是以葡萄糖為原料生產(chǎn)，生產(chǎn)異丁醇成本太高，并且隨著糧食價格的上漲及世界糧食資源的匱乏，以糧食為原料生物合成丁醇的發(fā)展必將處于劣勢。所以，針對第一種情況，采用基因工程和代謝工程技術(shù)，解除代謝過程中可能存在的產(chǎn)物或者中間產(chǎn)物的抑制，構(gòu)建對異丁醇耐受性更高的基因工程菌株，敲除其他支路的基因、切斷其生物合成，尋找自身含有高酶活的2-酮酸脫羧酶菌株等方法均為提高生物合成異丁醇產(chǎn)量的有效途徑。對于第二種情況，通過利用廉價非糧類原料生產(chǎn)異丁醇來降低其生產(chǎn)成本，以解決該產(chǎn)業(yè)所必須直面的瓶頸問題。

目前，新型生物燃料占全球運(yùn)輸燃料市場的份額不足2%。根據(jù)專家的預(yù)測，生物燃料在未來運(yùn)輸燃料結(jié)構(gòu)中將占有重要比重，在主要市場中可望達(dá)到20%-30%［34]。由于生物異丁醇生產(chǎn)與生物乙醇生產(chǎn)采用相似的工藝，現(xiàn)有的生物乙醇生產(chǎn)設(shè)施經(jīng)過改造便可轉(zhuǎn)而生產(chǎn)生物異丁醇。因此，生物異丁醇的市場潛力巨大?？紤]到糧食安全和生產(chǎn)成本的問題，生物異丁醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的出路在于應(yīng)用非糧類原料來生產(chǎn)異丁醇，如廢糖蜜 、農(nóng)作物秸稈，木薯和木質(zhì)纖維等。同時，隨著人們對木質(zhì)纖維素水解研究的深入和纖維素酶成本的降低，此類可再生資源用于異丁醇的發(fā)酵生產(chǎn)將成為必然的發(fā)展趨勢。另外，要增強(qiáng)異丁醇生物合成的經(jīng)濟(jì)競爭力，除了采用廉價原料外，還需要運(yùn)用基因工程和代謝工程等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建優(yōu)良工程菌，革新生物反應(yīng)器，采取先進(jìn)的發(fā)酵工藝和有效的回收技術(shù)等措施。

［1] 王丹, 林建強(qiáng), 張瀟, 等.直接生物轉(zhuǎn)化纖維素類資源生產(chǎn)然料乙醇的研究進(jìn)展［J] .山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2002,33（4）：525-529．

［2] Potera C. Forging isobutanol with modified microbes［J] .Genetic Eengineering & Biotechnogy News, 2009, 29（10）：18.

［3] Karabektas M, Hosoz M. Performance and emission characteristics of a diesel engine using isobutanol-diesel fuel blends［J] . Renew Energy, 2009, 34：1554-1559.

［4] Feldman R, Renny M. Yeast organism producing isobutanol at a high yield：US, 2009/0226991 A1［P] . 2009.

［5] 劉潤生.美國先進(jìn)生物燃料技術(shù)政策與態(tài)勢分析［J] .中國生物工程雜志, 2010, 30（01）：117-122．

［6] 程佳, 姜春波.異丁醇生產(chǎn)技術(shù)現(xiàn)狀及市場分析［J] .化學(xué)工業(yè),2007, 25（10）：28-31.

［7] Verkerk KAN, Jaeger B, Finkeldei CH, et al. Recent developments in isobutanol synthesis form synthesis gas［J] . Applied Catalysis A：General, 1999, 186（1-2）：407-431.

［8] 安煒, 牛玉琴, 陳正華.低碳醇合成中異丁醇形成機(jī)理及提高其收率的途徑［J] .燃料科學(xué)學(xué)報, 1994, 22（1）：63-69.

［9] Bramucci MG. Method for the production of isobutanol：US,2008/0274526A1［P] . 2008-11-6.

［10] Lin YL, Blaschek HP. Butanol production by a butanol-tolerant strain ofClostridium acellulolyticumin extruded corn broth［J] .Appl Environ Microbiol, 1983, 45（3）：966-973.

［11] Nair RV, Bennett GN, Papoutsakis ET. Molecular characterization of an aldehyde/alcohol dehydrogenase gene formClostridium acellulolyticumATCC824［J] . J Bacteriol, 1994, 176（3）：871-885.

［12] Dickinson JR, Harrison SJ, Hewlins MJE. An investigation of the metabolism of valine to isobutyl alcohol inSaccharomyces cerevisiae［J] . J Biol Chem, 1998, 273（40）：25751-25756.

［13] Fischer CR, Klein-Marcuschamer D, Stephanopoulos G. Selection and optimization of microbial hosts for biofuels production［J] .Metab Eng, 2008, 10：295-304．

［14] Atsumi S, Hanai T, Liao JC. Non-fermentative pathways for synthesis of branched chain higher alcohols as biofuels［J] . Nature, 2008,451：86-89．

［15] 郭媛. 通過非發(fā)酵途徑改造構(gòu)建利用蔗渣產(chǎn)異丁醇宿主菌株的研究［D] . 南寧：廣西大學(xué), 2010.

［16] Savrasova EA, Kivero AD, Shakulov RS, et al. Use of the valine biosynthetic pathway to convert glucose into isobutanol［J] . J Ind Microbiol Biotechnol, 2011, 38（9）：1287-1294.

［17] 林麗華, 郭媛, 龐浩, 等.大腸桿菌中表達(dá)關(guān)鍵基因產(chǎn)異丁醇的研究［J] .生物技術(shù), 2011, 21（3）：19-23.

［18] 郭媛, 林麗華, 黃日波, 等.基因敲除提高大腸桿菌工程菌生產(chǎn)異丁醇產(chǎn)量的研究［J] .生物技術(shù)通報, 2012（7）：170-175.

［19] Atsumi S, Wu TY, Eckl EM, et al. Engineering the isobutanol biosynthetic pathway inEscherichia coliby comparison of three aldehyde reductase/alcohol dehydrogenase genes［J] . Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85（3）：651-657.

［20] Smith KM, Liao JC. An evolutionary strategy for isobutanol production strain development inEscherichia coli［J] . Metabolic Engineering, 2011, 13（6）：647-681.

［21] Bastian S, Liu X, Meyerowitz JT, et al. Engineering ketol-acid reductoismerase and alcohol dehydrogenase enable anaerobic 2-methylpropan-1-ol production at theoretical yield inEscherichia coli［J] . Metabolic Engineering, 2011, 13（3）：345-352.

［22] Trinh CT, Li J, Blanch HW, et al. RedesigningEscherichia colimetabolism for anaerobic production of isobutanol［J] .Applied and Environmental Microbiology, 2011（77）：144894-144904.

［23] 潘超強(qiáng), 高強(qiáng), 鄭春陽, 等.產(chǎn)異丁醇關(guān)鍵基因在大腸桿菌中表達(dá)研究［J] .微生物學(xué)報, 2012, 39（7）：912-920.

［24] 謝夏.葡萄糖轉(zhuǎn)化異丁醇代謝途徑的設(shè)計(jì)與表達(dá)［D] .天津：天津大學(xué), 2010.

［25] Li SS, Wen JP, Jia XQ. EngineeringBacillus subtilisfor isobutanol production by heterologous Ehrlich pathway construction and the biosynthetic 2-ketoisovalerate precursor pathway overexpression［J] . Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91（3）：577-589.

［26] Li S, Huang D, Li Y, et al. Rational improvement of the engineered isobutanol-producingBucillus subitilisby elementary mode analysis［J] . Microb Cell Fact, 2012, 11：101.

［27] Chen X, Nielsen FK, Borodina I, et al. Incrcascd isobutanol production inSsaccharomyces cerevisiaeby overexpession of genes in valine metabolism［J] . Biotechnol Biofuels, 2011, 4：21.

［28] Krause FS, Blombach B, Eikmanns BJ. Metabolic engineering ofCorynebacterium glutamicumfor 2-ketoisovalerate production［J] .Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76（24）：8053-8061.

［29] 張路路, 劉暢, 任夢然, 等.幾種基因工程宿主菌異丁醇耐受能力的比較［J] .河北師范大學(xué)學(xué)報, 2011, 35（1）：86-89.

［30] Smith KM, Cho KM, Liao JC. Engineering forCorynebacterium glutamicumisobutanol production［J] . Appl Microbiol Biotechnol,2010, 87：1045-1055.

［31] Blombach B, Riester T, Wieschalka S, et al,Corynebacterium glutamicumtailored for efficient isobutanol production ［J] .Appl Environ Microbiol, 2011（77）：3300-3310.

［32] Atsumi S, Higashide W. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde［J] . Nature Biotechnology, 2009, 27（12）：1177-1180.

［33] Higashide W, Li YC, Yang YF, et al. Metabolic engineering ofClostridium cellulolyticumfor production of isobutanol from cellulose［J] . Appl Environ Microbil, 2011, 77（8）：2727-2733.

［34] 劉亞, 劉宏娟, 張建安, 等.新型生物燃料——丁醇的研究進(jìn)展［J] .現(xiàn)代化工, 2008, 28（6）：28-31.