殼聚糖修飾的PLGA納米顆粒固定化堿性磷酸單酯酶的技術(shù)研究

高啟禹 李宏彬 陳紅麗 孔雨 周晨妍

（1.河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 河南省遺傳性疾病與分子靶向藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新鄉(xiāng) 453003；2.河南新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003；3.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003）

堿性磷酸單酯酶（Alkaline phosphatase，AKP，EC3.1.3.1）是一種能催化各種磷酸單酯水解釋放出無機(jī)磷的酶，通常以前體的形式廣泛存在于原核及真核生物的外周胞質(zhì)中，最終在膜通道中形成成熟的堿性磷酸單酯酶［1］。該酶是一種非特異性的水解酶，能水解賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵等［2］。作為一種膜結(jié)合蛋白，一般可從小牛、豬和雞等動(dòng)物的腸粘膜上提?。?］，但由于從動(dòng)物體所獲得的目的蛋白在穩(wěn)定性、材料來源及分離純化上存在嚴(yán)重的缺陷，因此影響著AKP在DNA體外重組及化妝品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。同時(shí)作為分離獲得的游離酶，在保質(zhì)期、重復(fù)利用率、應(yīng)用成本及穩(wěn)定性上往往無法滿足生產(chǎn)需要。因此選用一定的固定化材料對(duì)游離酶進(jìn)行固定，可有效改善酶的應(yīng)用范圍及應(yīng)用價(jià)值。目前納米材料已成為酶固定化新型載體研究的熱點(diǎn)，已在酶的固定化研究中得到了廣泛的探討［4，5］。殼聚糖修飾的乳酸－羥基乙醇酸共聚物（PLGA）作為納米材料，能夠體現(xiàn)納米載體良好的生物相容性、較大的比表面積、較小的顆粒直徑、較小的擴(kuò)散限制、有效提高載酶量及在溶液中能穩(wěn)定存在等優(yōu)點(diǎn)［6］。

本研究在重組大腸桿菌堿性磷酸單酯酶基因的克隆、表達(dá)及純化的基礎(chǔ)上，通過合成的殼聚糖-PLGA納米材料為載體，對(duì)堿性磷酸單酯酶進(jìn)行了固定，同時(shí)采用戊二醛為交聯(lián)劑，優(yōu)化AKP的固定化條件，探討固定化酶與游離酶的酶學(xué)特性，旨在為該酶的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

PLGA（M=10 000-30 000，乳酸與羥基乙醇酸的摩爾比為50∶50，山東省醫(yī)療器械研究所），殼聚糖（低分子量，脫乙酰度85%，Sigma公司），重組大腸桿菌phoA（由華東理工大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供），Sephadex G-75、DEAE-纖維素（北京鼎國生物技術(shù)有限公司），谷胱苷肽（氧化型、還原型）、尿素、瓊脂糖、戊二醛等試劑采購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CS-PLGA納米粒的制備 采用超聲乳化法制備納米粒，見參考文獻(xiàn)［7，8］。

1.2.2 堿性磷酸單酯酶的分離與純化 將含有外源基因的重組菌培養(yǎng)后收集培養(yǎng)液，4 000 r/min，常溫離心20 min后收集菌體并超聲破碎，將破碎液在4℃、12 000 r/min下離心20 min，棄上清液，在沉淀中加入6 mL去離子水，攪拌后于4℃、12 000 r/min下離心20 min，重復(fù)洗滌后保留沉淀。在沉淀中加入1 mL溶解液（8 mol/L尿素），攪拌并于4℃冰箱放置溶解2 h。其后在4℃、12 000 r/min下再離心20 min，得上清液。在冰浴條件下緩慢加入復(fù)性液（0.01 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液+1 mmol/L氧化型谷胱苷肽+1 mmol/L還原型谷胱苷肽的混合液+1 mmol/L MgCl2+0.16 mol/L尿素），同時(shí)用玻棒輕輕攪勻后置于冰箱復(fù)性48 h，測活。

將粗酶液采用DEAE-纖維素凝膠及Sephadex G-75凝膠層析后洗脫、濃縮、透析，獲得純化的堿性磷酸單酯酶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立見參考文獻(xiàn)［9］。在405 nm處測吸光值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=1.242 9x-0.054 3，R2=0.991 8。結(jié)果表明對(duì)硝基苯酚在此濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，可以用于酶活力的測定。

圖1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4 堿性磷酸單酯酶酶活測定 以對(duì)硝基酚磷酸二鈉為底物，根據(jù)水解磷酯鍵所產(chǎn)生的對(duì)硝基酚量測定酶活力。在37℃、pH10.0條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1 μmol/L對(duì)硝基酚的酶量為1個(gè)酶單位。具體為：分別在試管中加入250 μL、0.02 mol/L對(duì)硝基酚磷酸二鈉及750 μL Na2CO3-NaHCO3（pH10.0，0.1 mol/L）的底物緩沖液，混勻，在水浴37℃預(yù)熱5 min，加入250 μL酶液（空白對(duì)照管用緩沖液替代），立即混勻后，37℃保溫反應(yīng)20 min。立即加入0.5 mL 0.5 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，于分光光度計(jì)中測定A405值。固定化酶活力測定時(shí)用一定量的固定化酶替換原酶液并用緩沖液定容，測定相應(yīng)吸光值并確定相對(duì)酶活力。

相對(duì)酶活力：以同組試驗(yàn)中酶活最高點(diǎn)的值記為100，相對(duì)酶活為其他試驗(yàn)點(diǎn)酶活值與該值之比。

固定化酶活力回收率（%）=固定化酶活力/投入的游離酶活力×100%

1.2.5 堿性磷酸單酯酶的固定化 取50 mg CS-PLGA納米粒，加入1 mL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH7.6）充分?jǐn)嚢韬蟪?5 min。再加入10 mL分離純化的酶溶液，在4℃攪拌吸附2 h后用4%的戊二醛溶液交聯(lián)1.5 h。再于4℃下固定10 h，離心棄去上清液，再用緩沖液洗去固定化酶表面游離酶后得固定化酶，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)論，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化堿性磷酸單酯酶的固定化條件。

2 結(jié)果

2.1 納米材料的電鏡掃描分析

納米粒的掃描電鏡顯示（圖1），未被殼聚糖修飾的PLGA納米粒球狀形態(tài)較規(guī)則（圖1-A），相互間結(jié)合度較小，而被修飾的納米材料結(jié)合較緊密（圖1-B），說明PLGA納米粒表面被殼聚糖進(jìn)行了有效修飾。

圖1 納米粒子的電鏡掃描

2.2 突變酶的表達(dá)及純化

SDS-PAGE分析（圖2）表明，重組大腸桿菌中堿性磷酸單酯酶得到了高效表達(dá)，同時(shí)經(jīng)凝膠層析后獲得了純度較高的酶液，其分子量介于43-66.2 kD之間，與AKP的理論分子量約50 kD相符合。

圖2 SDS-PAGE分析凝膠層析產(chǎn)物

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

設(shè)定固定化方法中其他影響因子不變，以選擇的影響因素為研究對(duì)象，探討在單因素條件下固定化酶的相對(duì)酶活力。

2.3.1 CS-PLGA納米粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固化酶活力的影響 由圖3可知，CS-PLGA納米顆粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶的活力有一定的影響，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度高于50 mg時(shí)，固定化酶的相對(duì)活力有所下降，可能較高濃度的載體在擴(kuò)散限制、有效載酶量等方面影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行。

圖3 CS-PLGA納米粒質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活力的影響

2.3.2 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固化酶活力的影響 采用雙功能試劑戊二醛進(jìn)行交聯(lián)固定對(duì)酶的固定化效果具有重要影響。圖4表明，在戊二醛濃度較低時(shí)，酶的結(jié)合量少，因而固定化酶活性較低。但當(dāng)戊二醛濃度過高時(shí)，過多的戊二醛與酶結(jié)合，使酶的空間剛性增加，柔性降低，從而影響酶與底物的結(jié)合，其適宜的戊二醛濃度約為4%。

圖4 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力的影響

2.3.3 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響 由圖5可知，固定化堿性磷酸單酯酶的活力在交聯(lián)時(shí)間1.5 h時(shí)最高。主要是由于低于1.5 h時(shí)，戊二醛和酶蛋白的結(jié)合不完全，而高于1.5 h時(shí)，過多的醛基對(duì)酶分子本身進(jìn)行了相應(yīng)的修飾，致使固定化酶活力降低。

圖5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

2.3.4 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響 由圖6可以看出，固定化酶的活力受固定化時(shí)間的影響。在固定化時(shí)間為10 h 時(shí)，固定化酶的活力達(dá)到最大值。同時(shí)由于酶與載體的結(jié)合需要相應(yīng)的時(shí)間，因此固定化初期其酶活較低，但在達(dá)到最大值后，延長固定化時(shí)間會(huì)導(dǎo)致酶交聯(lián)程度過高，形成的載體結(jié)構(gòu)對(duì)酶的結(jié)合能力降低，從而影響到酶促反應(yīng)的速率。

圖6 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

2.3 CS-PLGA納米材料固定木聚糖酶的條件優(yōu)化

表1 因素水平表

由表1和表2可知，對(duì)于固定化堿性磷酸單酯酶的活力，根據(jù)極差分析R值可以看出，影響固定化酶酶活的因素主次順序依次為A、C、B、D，根據(jù)其K值判斷組成的最優(yōu)組合為A2C3B2D1，即最佳固定化條件為納米顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 mg、戊二醛體積分?jǐn)?shù)4%、交聯(lián)時(shí)間2.0 h、固定化時(shí)間9.0 h。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，在極差分析得到的最佳條件下，測得固定化酶的酶活回收率為76.2%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4 固定化和游離酶最適pH值及pH穩(wěn)定性

酶分子在水溶液環(huán)境中的解離狀態(tài)和酶與底物的親和力都受到pH的影響。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）分析及圖7顯示，AKP被固化后其最適反應(yīng)pH值有所變化，pH分別由9.5變化為10.0，且保持了較高的活性。同時(shí)對(duì)熱穩(wěn)定性的研究（圖8）發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下，固定化酶更穩(wěn)定。

圖7 pH對(duì)游離酶及固定化酶酶活力的影響

圖8 游離酶及固定化酶的pH穩(wěn)定性

2.5 固定化木聚糖酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

圖9 溫度對(duì)游離酶及固定化酶的影響

圖10 游離酶及固定化酶的溫度穩(wěn)定性

溫度對(duì)酶活性有顯著影響，在一定的溫度范圍，由于產(chǎn)生了更多的活化分子而使酶的活性升高，但溫度過高會(huì)引起蛋白變性，導(dǎo)致酶活性逐漸喪失。圖9顯示，游離酶與固定化酶的最適溫度未發(fā)生明顯變化，均為45℃，但經(jīng)SD分析發(fā)現(xiàn)，固定化酶的適應(yīng)溫度范圍較自由酶更加廣泛。同時(shí)對(duì)固定化酶的熱穩(wěn)定性研究（圖10）發(fā)現(xiàn)，在45℃水浴保溫90 min后，固定化酶的活性保持在60%左右，而游離酶的活力約為40%，說明酶被固定化后其熱穩(wěn)定性有所增強(qiáng)。

3 討論

自酶固定化技術(shù)誕生近百年以來，各種固定化載體材料獲得了大量研究，特別是隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料作為固定化酶的新型載體，在酶的固定化應(yīng)用上體現(xiàn)了極高的表面積/體積比，致使固定化的物質(zhì)集中化，從而提高了酶的固載量，獲得了較優(yōu)良的固定化酶。但是在對(duì)不同酶進(jìn)行納米材料固定化的應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，單一地采用未經(jīng)修飾的納米材料的固定化效果往往會(huì)因?yàn)椴牧媳旧淼淖晕覉F(tuán)聚而導(dǎo)致酶活性的嚴(yán)重下降［10］。因而采用某些試驗(yàn)技術(shù)，在合成的納米載體表面引入不同的化學(xué)基團(tuán)（如-CHO、-NH、-OH、-COOH、-SH等），或連接上具有特殊功能的大分子物質(zhì)（如糖類、酯類等），從而構(gòu)建具有復(fù)合功能的納米材料。研究表明，復(fù)合材料的固定化效果更加明顯，能在保持較高酶活的同時(shí)，拓寬了酶的穩(wěn)定性，改善了酶的操作半衰期等［11］，從而為提高酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了較好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

通過對(duì)PLGA納米材料載體進(jìn)行殼聚糖的修飾，獲得了復(fù)合材料CS-PLGA，同時(shí)采用戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)在重組大腸桿菌中表達(dá)的堿性磷酸單酯酶進(jìn)行了分離純化和固定，探討了酶的最佳固定化條件。通過單因素分析、正交設(shè)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)，在納米顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 mg、戊二醛體積分?jǐn)?shù)4%、交聯(lián)時(shí)間2.0 h、固定化時(shí)間9.0 h條件下，固定化酶的活力最高。同時(shí)對(duì)游離酶及固定化酶的最適pH、最適溫度及pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行了相應(yīng)的探討，研究發(fā)現(xiàn)，AKP采用納米載體CS-PLGA固定后，拓寬了其最適反應(yīng)條件及其穩(wěn)定性。

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